張?jiān)?劉錫玲 畢 路 李 佳 方 瑞 李 乾 趙俊龍 畢丁仁 黃 麗 步志高 翁長江*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/ 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150069；2.武漢觀銳生物科技有限公司，武漢430070；3.武漢科維創(chuàng)生物科技有限公司，武漢430014

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬和各種野豬（如非洲野豬、歐洲野豬等）引起的一種急性、出血性、烈性傳染病[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動物疫病，該病也是我國重點(diǎn)防范的一類動物疫情。2018年8月3日，我國遼寧省某養(yǎng)殖場生豬發(fā)生疑似ASF 疫情，經(jīng)確認(rèn)并上報(bào)OIE 確診為我國首例非洲豬瘟[2]。而后疫情相繼席卷全國，截至2020年1月初，國內(nèi)共報(bào)告發(fā)生162 起非洲豬瘟疫情，共撲殺染疫生豬約120 萬頭，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因非洲豬瘟病毒的感染機(jī)制復(fù)雜，基因型多，全球尚無安全有效的商品化疫苗，其防控難度較大。

非洲豬瘟的早期快速診斷包括病原學(xué)檢測和血清學(xué)檢測，OIE 推薦的ASF 實(shí)驗(yàn)室檢測方法有病毒分離、PCR、ELISA 和熒光抗體試驗(yàn)等。在ASF 暴發(fā)初期，普遍采用PCR 檢測病原以確診病例，但在ASF 呈地方流行趨勢后，病原檢測試驗(yàn)（FAT）和血清學(xué)試驗(yàn)（IFA）的結(jié)合有利于對可疑病例、隱性病例進(jìn)行確診。ELISA 方法是目前最常用的血清學(xué)診斷方法，用于抗體的檢測，已有多項(xiàng)研究報(bào)道采用非洲豬瘟病毒p72、p54、p30 等基因表達(dá)重組蛋白并建立了非洲豬瘟病毒抗體ELISA 檢測方法[4-7]。ELISA 檢測方法一般在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，需要一定的設(shè)備，同時(shí)相對耗時(shí)較長，而膠體金免疫層析技術(shù)因其快速、靈活、靈敏的特點(diǎn)，在臨床快速檢測診斷中尤為適合。本研究對采用膠體金免疫層析技術(shù)制備的快速檢測試紙卡檢測非洲豬瘟病毒抗體的性能和效果進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡，由武漢觀銳生物科技有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所共同制備，批號：200501，有效期至2021年5月。

2）非洲豬瘟病毒阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，購自西班牙INGENASA，批號：011019-B，有效期至2021年10月。

3）非洲豬瘟病毒間接ELISA 抗體檢測試劑盒；非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，豬流行性腹瀉病毒（PEDV），豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV），豬瘟病毒（CSFV），偽狂犬病毒（PRV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體陽性血清，大腸桿菌BL21 空載體陽性血清，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸藥研究所制備并提供。

4）豬臨床血清230 份，從湖北、河南、江西、上海等地采集或送檢。

1.2 方 法

1）敏感性試驗(yàn)。將非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（ELISA 測定效價(jià)，1∶32 768）用稀釋液倍比稀釋后，用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測，以肉眼能觀察到檢測線處有紅色沉淀線出現(xiàn)的血清最高稀釋倍數(shù)為試紙卡的檢測敏感度。

2）特異性試驗(yàn)。用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡分別檢測非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和5 種其他病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（PEDV、TGEV、CSFV、PRV、PRRSV）以及大腸桿菌BL21 空載體陽性血清，進(jìn)行試紙卡特異性評價(jià)。

3）已知陽性血清檢測試驗(yàn)。用非洲豬瘟病毒分離株（ASFV/HLJ/2018-△X）攻毒3 頭SPF 豬（編號123），分別在攻毒第0 天、第5 天、第8 天采集并分離豬血清（P4 實(shí)驗(yàn)室完成），再用非洲豬瘟病毒ELISA 抗體檢測試劑盒和非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測。

4）符合率實(shí)驗(yàn)。臨床采集230 份豬血清樣品，每份樣品用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測，同時(shí)用西班牙INGENASA 非洲豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測，并將檢測結(jié)果進(jìn)行比較，評價(jià)二者的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感性試驗(yàn)

用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測倍比稀釋后的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)果如圖1。當(dāng)稀釋度達(dá)1∶256 時(shí)，檢測線處仍然呈現(xiàn)肉眼可見的清晰的紅色沉淀線，表明試紙卡檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的敏感度為1∶28，說明本研究制備的試紙卡在非洲豬瘟病毒抗體檢測臨床應(yīng)用中的敏感性較高。

2.2 特異性試驗(yàn)

用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、空載體血清及5 份其他病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清時(shí)，結(jié)果如圖2 所示。試紙卡除檢測非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為陽性（檢測線顯色）外，其余血清均為陰性（檢測線不顯色），表明試紙卡的特異性很強(qiáng)。

圖1 非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡敏感性試驗(yàn)

2.3 已知陽性血清檢測試驗(yàn)

用間接ELISA 試劑盒和試紙卡方法同時(shí)檢測3頭攻毒前（0 天）、攻毒第5 天、第8 天采集分離的豬血清，如表1 和圖3 所示。ELISA 和試紙卡均在攻毒后第8 天檢測出非洲豬瘟病毒抗體，表明非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡與ELISA 方法檢測結(jié)果一致，均能在豬感染非洲豬瘟病毒后及早地檢測到抗體。

2.4 與進(jìn)口非洲豬瘟病毒抗體檢測ELISA 試劑盒符合率試驗(yàn)

將230 份臨床豬血清樣品同時(shí)用非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡和西班牙INGENASA 非洲豬瘟病毒阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測。結(jié)果如表2 所示，試紙卡檢出陽性血清樣本101 份，陰性血清129份；ELISA 試劑盒檢出陽性血清110 份，陰性血清120 份。其中，陽性符合率80%，陰性符合率為89.2%，總符合率為84.8%，表明二者有很高的符合率。

圖2 非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡特異性試驗(yàn)

表1 ELISA 方法和非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測攻毒豬血清結(jié)果

圖3 非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡檢測攻毒豬抗體結(jié)果

表2 非洲豬瘟病毒抗體檢測試紙卡與進(jìn)口非洲豬瘟病毒抗體檢測ELISA 試劑盒的比較

3 討 論

我國非洲豬瘟暴發(fā)流行已近2年，防控非洲豬瘟將成為養(yǎng)豬企業(yè)的一項(xiàng)重要長期任務(wù)。按一般傳染病流行規(guī)律，非洲豬瘟病毒毒力可能會下降，使病程呈向亞急性或慢性發(fā)展，發(fā)病豬群死亡率下降，耐過或無癥狀感染豬增多，帶毒豬可能呈間歇式排毒狀態(tài)，因而活體采樣檢測核酸或抗原有時(shí)均呈陰性。但由于非洲豬瘟病毒抗原性強(qiáng)，康復(fù)豬或隱性帶毒豬循環(huán)抗體長時(shí)間呈陽性，且效價(jià)極高，因而很容易被快速檢測法檢測出來。所以，在非洲豬瘟流行中、后期，對致死率不高的發(fā)病群中的病豬作“拔牙”式處理，結(jié)合嚴(yán)格的生物安全措施和早期診斷與鑒別技術(shù)，精準(zhǔn)淘汰PCR 陽性或抗原陽性或抗體陽性豬只，能取得很好的防控效果。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的非洲豬瘟防控強(qiáng)化措施指引中指出，對自檢陽性豬群且無異常死亡的養(yǎng)殖場，可按照“精準(zhǔn)撲殺、定點(diǎn)清除”策略對生豬進(jìn)行處置[8]。

本研究采用雙抗原夾心法制備出非洲豬瘟抗體檢測試紙卡，該試紙卡特異性強(qiáng)、靈敏度高，能快速查出豬群中外觀正常的隱性感染豬，被查出的這部分高效價(jià)抗體陽性豬可能會帶毒，是豬群中的危險(xiǎn)傳染源，必須予以淘汰，以斬?cái)喾侵挢i瘟的流行和蔓延。因此，非洲豬瘟抗體檢測試紙卡的研制成功為我國非洲豬瘟的控制與根除提供了很好的技術(shù)支持。