鄧軍 羅正良 朱菲瑩 陳希 方勇 任鄄勝 任光俊 高方遠

摘要：【目的】克隆水稻B-box鋅指蛋白基因（OsBBX26），并分析其在非生物脅迫下的表達模式，為探究水稻B-box蛋白的非生物脅迫響應(yīng)機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳运灸Ｊ狡贩N日本晴為材料，采用RT-PCR克隆OsBBX26基因，對其進行生物信息學分析，并通過構(gòu)建pBA-OsBBX26-YFP植物表達載體進行亞細胞定位。同時，采用實時熒光定量PCR檢測分析OsBBX26基因的組織特異性及非生物脅迫（干旱、ABA、低溫和高鹽）下的表達模式?！窘Y(jié)果】克隆獲得的OsBBX26基因（LOC_Os08g42440）cDNA全長序列為1467 bp，編碼488個氨基酸，其編碼蛋白分子量為51.86 kD，理論等電點（pI）為6.63，包含1個B-box鋅指結(jié)構(gòu)域和1個CCT結(jié)構(gòu)域，其中B-box結(jié)構(gòu)域位于第13～60位氨基酸，CCT結(jié)構(gòu)域位于第435～478位氨基酸，該蛋白定位于細胞核中。OsBBX26基因位于8號染色體上，啟動子區(qū)域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還含有與逆境相關(guān)的順式作用元件，包括低溫響應(yīng)元件LTR、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、厭氧響應(yīng)元件ARE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。OsBBX26蛋白與粳稻B-box蛋白親緣關(guān)系最近，其次與秈稻B-box蛋白親緣關(guān)系較近，與其他植物B-box蛋白也存在較高的相似性，其中與小米、大麥、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分別達72%、72%、71%、69%和68%。OsBBX26基因在幼葉中的表達量最高，其次是在成熟葉片中，在幼根、成熟根、莖和幼穗中的表達量均極低，表明該基因表達具有明顯的組織表達特異性。干旱、高鹽、ABA和低溫脅迫處理下OsBBX26基因均上調(diào)表達，干旱、高鹽和ABA脅迫處理12 h達峰值，但低溫脅迫處理在24 h后才達峰值?！窘Y(jié)論】OsBBX26基因受干旱、高鹽、ABA和低溫脅迫誘導均上調(diào)表達，推測其參與水稻植株響應(yīng)多種非生物脅迫，在逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 水稻;B-box蛋白;克隆;非生物脅迫;表達分析;組織表達

中圖分類號： S511.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1606-08

Abstract：【Objective】The research cloned B-box zinc-finger protein gene（OsBBX26） from rice，analyzed its bioinformatics information and expression under abiotic stress，in order to provide a theoretical basis for the further study of the role of B-box? protein in the abiotic stress response system of rice. 【Method】Taking rice variety Nipponbare as material， OsBBX26 gene was cloned by RT-PCR，bioinformatics was also conducted. pBA-OsBBX26-YFP expression vector was established for subcellular localization.? At the same time，real-time fluorescent quantitative PCR was adopted for expressing OsBBX26 gene tissue specific expression and abiotic stress（drought，ABA，low temperature and high salt）. 【Result】The full length cDNA sequence of OsBBX26 gene（LOC_Os08g42440） was 1467 bp which encoded 488 amino acids.? Its molecular weights was 51.86 kD with isoelectric points（pI） being 6.63. This gene contained a B-box zinc finger domain which located in the 13-60 amino acids and a CCT domain located in the 435-478 amino acids. The subcellular localization analysis showed that OsBBX26 protein was in the nucleus， and OsBBX26 gene located on chromosome 8. The promoter regions contained not only the TATA-Box and CAAT-Box，but some adversity stress related cis elements，such as low temperature response element LTR，abscisic acid response element ABRE，salicylic acid response element TCA-element，anaerobic response element ARE，methyl jasmonic acid response element CGTCA-motif and TGACG-motif，and MYB transcription factor binding sites. Furthermore，the sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that OsBBX26 protein had the closest relationship with B-box protein of Japonica rice，followed by b-box protein of Indica rice，and had high similarity with B-box protein sequences of other plants，and the similarity with Setaria italica，Hordeum vulgare，Sorghum bicolor，Zea mays and Brachypodium distachyon reached 72%，72%，71%，69% and 68%，respectively.? OsBBX26 was expressed the highest in young leaves，followed by mature leaves，and the expression level was very low in young roots，mature roots，stems and young ears. Moreover，results showed that the expression of OsBBX26 gene was up-regulated under drought，high salt，ABA and low temperature stresses. And the the maximum value was reached under drought，high salt and ABA treatment at 12 h while 24 h under low temperature treatment. 【Conclusion】OsBBX26 gene is up-regulated in response to drought，high salt，ABA and low temperature stresses. Therefore，it is speculated that OsBBX26 gene participates multiple abiotic stresses in rice and plays significant role in response to various abiotic stresses.

Key words： rice; B-box protein; cloning abiotic stresses; expression analysis;tissue expression

Foundation item： National Key Research and Development Program（2018YFD0301001）; Agricultural Science and Technology Innovation Fund Project of Hunan（2018QN36）

0 引言

【研究意義】對植物生存和生長發(fā)育不利的環(huán)境因子可分為非生物脅迫（干旱、鹽害、高溫、低溫、霜凍等）和生物脅迫（病蟲害、雜草等），其中，非生物脅迫嚴重影響植物生長發(fā)育，是制約農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素（鄭曉瑜等，2011;曾露桂等，2020）。尤其是近年來，在全球氣候變暖的大背景下，我國極端天氣（高溫、干旱、洪澇和冰凍等）頻繁發(fā)生，導致作物產(chǎn)量下降，甚至死亡，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失（向建華等，2012）。B-box（BBX）蛋白是植物生長發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物形態(tài)建成、花器官發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)過程中的多種生命活動（Gangappa and Botto，2014）。水稻是世界上重要的糧食作物，克隆其B-box基因并分析其在逆境脅迫下的表達情況，可為深入研究水稻B-box基因參與非生物脅迫的響應(yīng)機制提供理論參考，對提高水稻抗逆性及品種改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】B-box是鋅指蛋白的亞家族成員之一，在N端包含由1或2個B-Box基序組成的B-box結(jié)構(gòu)域，C端還含有1個特異的CCT結(jié)構(gòu)域（CONSTANS、CO-like和TOC1）（Huang et al.，2012）。其中，擬南芥B-box蛋白家族由32個具有B-box結(jié)構(gòu)域的蛋白組成，統(tǒng)一命名為AtBBX1～AtBBX32（Khanna et al.，2009）;水稻B-box蛋白家族有30個成員，統(tǒng)一命名為OsBBX1～OsBBX30（Huang et al.，2012）。研究表明，B-box蛋白參與植物幼苗去黃化、下胚軸伸長、花青素產(chǎn)生、葉綠素積累、側(cè)根伸長和子葉展開等光形態(tài)建成過程，且與植物光周期及花期的信號通路相關(guān)（Datta et al.，2006，2007，2008;Fan et al.，2012）。另外，B-box蛋白在抗生物脅迫和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，可調(diào)控植物相關(guān)基因表達以抵抗逆境脅迫。擬南芥AtBBX24/STO蛋白參與植株鹽脅迫信號通路，可提高轉(zhuǎn)AtBBX24/STO基因酵母對高鹽的耐受性（Indorf et al.，2007）;AtBBX18基因下調(diào)表達后能增強植物的耐熱性，但超表達后耐熱性減弱（Wang et al.，2012）;轉(zhuǎn)水稻OsBBX25基因的擬南芥植株過表達可顯著提高其耐鹽性（劉焱等，2012）。近年來，油菜（胡茂龍等，2016）、水稻（駱鷹等，2017;黎妮等，2019）、山梨（王日紅等，2019）等植物的B-box基因功能已得到研究與鑒定，均證實其與非生物逆境脅迫密切相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)水稻B-box基因家族成員如OsBBX6和OsBBX22（駱鷹等，2017）等基因功能的研究相對較少，對其在非生物脅迫中的作用機制尚不清楚，且未見有關(guān)水稻OsBBX26基因克隆及表達分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以水稻模式品種日本晴為材料，采用RT-PCR克隆OsBBX26基因并進行生物信息學分析，構(gòu)建GFP表達載體并進行亞細胞定位分析，同時通過實時熒光定量PCR檢測分析OsBBX26基因的組織表達特異性及非生物脅迫下的表達模式，為進一步了解水稻B-box基因在非生物脅迫中的響應(yīng)機制提供理論依據(jù)，也為水稻抗逆分子育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試水稻品種為日本晴，其種子由四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。擴增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。克隆載體Trans-T1和pEASY-Blunt購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;熒光定量PCR試劑購自瑞士Roche公司;cDNA第一鏈合成試劑盒、限制性內(nèi)切酶和高保真酶購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）;大腸桿菌DH5α由湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所實驗室保存提供。

1. 2 材料處理

選取飽滿日本晴種子，用清水沖洗并浸泡48 h后置于35 ℃培養(yǎng)箱催芽。將催芽后露白的種子平鋪在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)至3葉期。取部分水稻幼苗分別進行干旱（15% PEG-8000）、高鹽（200 mmol/L NaCl）、脫落酸（ABA，100 μmol/L）及低溫（4 ℃）等脅迫處理，以不作脅迫處理的水稻幼苗為對照，在脅迫處理0、2、4、6、8、10、12和24 h時分別剪取幼根和幼葉各100 mg，用液氮速凍后-80 ℃保存，用于非生物脅迫下OsBBX26基因表達分析。此外，取20株水稻幼苗移栽于湖南省農(nóng)業(yè)科學院高橋基地，常規(guī)田間管理，分別于3葉期取幼葉和幼根，孕穗期取幼穗及成熟的根、莖、葉，用液氮速凍后-80 ℃保存，用于基因組織特異性分析。上述材料均進行3次重復取樣。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

取100 mg水稻組織樣品在液氮中速凍并研碎，參照植物RNA提取試劑盒說明抽提總RNA，使用核酸蛋白儀測定RNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。然后將提取質(zhì)量較好的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 基因克隆

以水稻基因組中OsBBX26基因序列（LOC_Os08g 42440）為參考序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計2對巢式PCR引物（G2OE-F1：5'-CAAAAGTCGTCGT AGACCCCC-3';G2OE-R1：5'-GCATGGATATGCCT ATCAGAAT-3'和G2OE-F2：5-CCCAAAGCTTGGT TTGCGAGATGAAGGATG-3';G2OE-R2：5'-GCTT CTA GAATCAGGGATTGCAGGGATGA-3'）。以日本晴3葉期葉片cDNA為模板，采用Primer STAR高保真酶進行第一次巢式PCR擴增。反應(yīng)體系25.00 μL：1.00 μL cDNA模板，10 μmol/L上、下游引物各1.00 μL、10×Buffer 2.50 μL，dNTPs 2.00 μL，Primer STAR高保真酶0.25 μL，用ddH2O補足至25.00 μL。擴增程序：98 ℃預變性3 min;98 ℃ 10 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，共進行34個循環(huán);72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。取第一次PCR產(chǎn)物1.00 μL為模板進行第二次巢式PCR，反應(yīng)體系和擴增程序同第一次巢式PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收純化目的片段，連接到pEASY-Blunt克隆載體上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 5 生物信息學分析

采用DNAMAN 6.0進行基因序列分析及多序列比對。利用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search）預測分析OsBBX26基因的開放閱讀框（ORF）及其編碼蛋白的理論等電點（pI）和分子量;在PlantCARE對基因啟動子區(qū)域進行順式作用元件分析;通過NCBI數(shù)據(jù)庫對OsBBX26蛋白的氨基酸序列進行BLASTp同源比對，選取其他植物中相似性高的蛋白氨基酸序列，用ClustalX 2.1進行多序列比對，并以MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 亞細胞定位

根據(jù)OsBBX26基因的ORF序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計亞細胞定位表達載體引物OsBBX26-F：5'-CCCTCGAGATGAAGGATGGTGGTGGAGG A-3'（下劃線處為Xho I酶切位點）;OsBBX26-R：5'-C GGGATCCCCCGCCATTGCTGACATCATC-3'（下劃線處為BamH I酶切位點），其中，下游引物Os-BBX26-R不包含終止密碼子。PCR反應(yīng)體系和擴增程序同1.4，連接至pEASY-Blunt克隆載體上，熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。用Xho I和BamH I雙酶切pEASY-Blunt-OsBBX26質(zhì)粒與pBA-YFP表達載體質(zhì)粒，回收目的片段與pBA-YFP載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性克隆，再提取其質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，挑選酶切鑒定正確的陽性單克隆進行測序（騰海艷，2020）。重組質(zhì)粒命名為pBA-OsBBX26-YFP，最后利用Biolistic PDS-1000/He基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，25 ℃培養(yǎng)16 h（朱建楚等，2003;騰海艷，2020），然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1. 7 實時熒光定量PCR

根據(jù)OsBBX26基因cDNA序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量PCR引物（G2RT-F：5'-AG TG CCACCAACCCAGATA-3';G2RT-R：5'-TCGTTGTC CCAGAAGAAATC-3'），在LightCycler[?] 96 Instrument型熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系20.00 μL：包括cDNA模板2.00 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.40 μL，2×SybrGreen qPCR Mix 10.00 μL，用蒸餾水補足至20.00 μL。擴增程序：95 ℃預變性1 min;95 ℃ 7 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，進行40個循環(huán)。以水稻actin基因作為內(nèi)參，其引物為actin-F：5'-CCACTATGTTCCCTGGCATT-3';actin-R：5'-GTACTCAGCCTTGGCAATCC-3'。采用2-??Ct法計算基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 OsBBX26基因克隆及序列分析結(jié)果

以日本晴3葉期葉片cDNA為模板進行巢式PCR擴增，獲得1條約1500 bp的片段（圖1）。經(jīng)過測序、拼接和驗證，獲得OsBBX26基因cDNA全長序列為1467 bp，編碼488個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為51.86 kD，pI為6.63，該蛋白包含1個B-box結(jié)構(gòu)域和1個CCT結(jié)構(gòu)域，其中，B-box結(jié)構(gòu)域位于第13～60位氨基酸，CCT結(jié)構(gòu)域位于第435～478位氨基酸（圖2）。

2. 2 OsBBX26基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果

OsBBX26基因（LOC_Os08g42440）位于水稻8號染色體上，其啟動子區(qū)域順式作用元件分析結(jié)果顯示，除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還含有與逆境相關(guān)的順式作用元件，包括低溫響應(yīng)元件LTR、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、厭氧響應(yīng)元件ARE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。此外，含有大量光響應(yīng)元件，如MRE、BOX4、TCT-motif、GT1-motif、G-Box、ATC-motif和AE-box等。

2. 3 OsBBX26蛋白同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTp同源比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsBBX26蛋白與其他植物B-box蛋白具有較高的相似性，其中與小米（Setaria italic）CONSTANS-LIKE 15-like（XP_004974025.1）、大麥（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）partial predicted protein（BAJ87 189.1）、高粱（Sorghum bicolor）SORBIDRAFT_07g 025940（XP_002444681.1）、玉米（Zea mays）ZEAM MB73_333025（DAA48275.1）和短柄草（Brachypodium distachyon）CONSTANS-LIKE14-like（XP_003574843.1）的氨基酸序列性分別達72%、72%、71%、69%和68%（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果顯示，OsBBX26蛋白與粳稻（Oryza sativa Japonic）OsJ_28089（EAZ43482.1）親緣關(guān)系最近，其次是與秈稻（O. sativa Indica）OsI_30045（EEC83950.1）（圖4）。

2. 4 OsBBX26蛋白亞細胞定位分析結(jié)果

利用基因槍法在洋蔥表皮細胞中瞬時表達OsBBX26-YFP融合蛋白。使用激光共聚焦顯微鏡在白光（明場）、熒光（暗場）及合成（白光+熒光）3種條件下進行觀察，發(fā)現(xiàn)OsBBX26-YFP融合蛋白主要在細胞核內(nèi)表達（圖5），說明OsBBX26蛋白定位于細胞核中。

2. 5 OsBBX26基因的組織表達分析結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測OsBBX26基因在水稻不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示，OsBBX26基因在幼葉中表達量最高，其次是在成熟葉片，在幼根、成熟根、成熟莖和幼穗中表達量均極低（圖6），表明Os-BBX26基因具有明顯的組織表達特異性。

2. 6 非生物脅迫處理下OsBBX26基因的表達模式

干旱、高鹽、ABA和低溫脅迫處理下，日本晴幼根和幼葉中OsBBX26基因的表達模式分析結(jié)果如圖7所示。在4種脅迫處理下，OsBBX26基因表達量在幼根中無明顯變化，均表達量極低，但在幼葉中表達量存在明顯差異，其中ABA和干旱脅迫處理0～12 h OsBBX26基因表達量整體上呈上升趨勢，均在脅迫處理12 h達峰值，脅迫處理24 h降至最低值，但干旱脅迫處理后OsBBX26基因表達量明顯高于ABA脅迫處理;高鹽和低溫脅迫處理0～24 h，OsBBX26基因的表達量均呈波動式變化，但不同的是，高鹽脅迫處理6～12 h的表達量較其他時間點高，脅迫處理12 h達峰值，脅迫處理24 h降至最低值，而低溫脅迫處理6～24 h的表達量較其他時間點高，且呈先降低后升高的變化趨勢，于脅迫處理24 h達峰值，低溫脅迫下Os-BBX26基因表達量整體高于高鹽脅迫。綜上所述，水稻幼葉OsBBX26基因在低溫、高鹽、ABA和干旱脅迫響應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。

3 討論

鋅指蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，是植物轉(zhuǎn)錄因子中相對較大的基因家族（約占轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的15%），在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用（Liu et al.，2007;Kim et al.，2008;Jan et al.，2013;姚琦園等，2018）。B-box蛋白是鋅指蛋白的亞家族成員之一，是植物生長發(fā)育過程中重要轉(zhuǎn)錄因子，當植物受逆境脅迫后能誘導該蛋白基因上調(diào)表達，表明B-box蛋白在逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。寧露云等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛PhBBX8基因在低溫、干旱、ABA、茉莉酸甲酯（MeJA）、高鹽和高滲透脅迫處理下不同程度上調(diào)表達，故推測該基因參與矮牽牛非生物脅迫響應(yīng);王日紅等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，山梨PuBBX24基因在ABA、光、低溫、高滲透及高鹽脅迫處理下顯著上調(diào)表達，表明山梨PUBBX24可能參與ABA、光及非生物脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果表明，OsBBX26基因在水稻受到干旱、高鹽、ABA和低溫脅迫后均能誘導上調(diào)表達，說明OsBBX26基因是正調(diào)控響應(yīng)非生物脅迫，與上述研究結(jié)果基本一致。但黎妮等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsBBX13基因在逆境脅迫下呈下調(diào)表達，表明其可能負調(diào)控響應(yīng)非生物脅迫。此外，B-box鋅指蛋白基因在不同逆境脅迫下的表達量及峰值出現(xiàn)時間存在明顯差異。劉焱等（2012）研究結(jié)果顯示，水稻OsBBX25基因表達量分別在高鹽脅迫4 h后達峰值，干旱脅迫1 h后達峰值，ABA脅迫3 h后達峰值;竇錦青等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，低溫、干旱、ABA和鹽脅迫等非生物逆境可誘導BLCOL13基因表達，其表達量分別在干旱脅迫后12 h達峰值，低溫脅迫后24 h達峰值，鹽脅迫后6 h達峰值;胡茂龍等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，高鹽、干旱和高溫能顯著誘導油菜BnSTO-1和BnSTO-2基因表達，但出現(xiàn)峰值的時間不同，BnSTO-1和BnSTO-2基因表達量分別在高鹽脅迫6 h后達峰值，干旱脅迫3 h后達峰值，高溫脅迫12 h后達峰值。本研究結(jié)果顯示，Os-BBX26基因在表達量均在干旱、高鹽和ABA脅迫處理后12 h達峰值，但低溫脅迫處理24 h后達峰值。綜上所述，推測不同物種不同B-box基因?qū)Ψ巧锩{迫響應(yīng)機制不同。本研究后續(xù)工作將構(gòu)建植物過表達載體和基因編輯載體并遺傳轉(zhuǎn)化水稻，從而驗證OsBBX26基因在水稻非生物脅迫中的調(diào)控功能。

4 結(jié)論

OsBBX26基因受干旱、高鹽、ABA和低溫脅迫誘導均上調(diào)表達，推測其參與水稻植株響應(yīng)多種非生物脅迫，在逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

參考文獻：

竇錦青，程龍軍，徐鳳華，張俊紅，童再康. 2015. 光皮樺BBX類基因BICOL13的克隆與表達分析[J]. 園藝學報，42（7）：1367-1377. [Dou J Q，Cheng L J，Xu F H，Zhang J H，Tong Z K. 2015. Cloning and expression analysis of a B-box-type protein gene BICOL13 in Betula luminifera[J]. Acta Horticulturae Sinica，42（7）：1367-1377.]

胡茂龍，龍衛(wèi)華，高建芹，張潔夫，陳松，浦惠明. 2016. 油菜B-box型鋅指蛋白基因BnSTO的克隆和表達[J]. 中國農(nóng)學通報，32（36）：96-103. [Hu M L，Long W H，Gao J Q，Zhang J F，Chen S，Pu H M. 2016. Cloning and expression of BnSTO encoding B-box-type zinc-finger proteins in rapeseed[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，32（36）：96-103.]

黎妮，張超，王偉平. 2019. 水稻鋅指蛋白基因OsBBX13的克隆、表達及生物信息學分析[J]. 分子植物育種，17（5）：1393-1400. [Li N，Zhang C，Wang W P. 2019. Cloning，expression and bioinformatics analysis of zinc finger protein gene OsBBX13 in rice[J]. Molecular Plant Breeding，17（5）：1393-1400.]

劉焱，邢立靜，李俊華，戴紹軍. 2012. 水稻含有B-box鋅指結(jié)構(gòu)域的OsBBX25蛋白參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)[J]. 植物學報，47（4）：366-378. [Liu Y，Xing L J，Li J H，Dai S J. 2012. Rice B-box zinc finger protein OsBBX25 is involved in the abiotic response[J]. Chinese Bulletin of Bo-tany，47（4）：366-378.]

駱鷹，謝旻，張超，王偉平，朱建華，萬向元，汪啟明，饒力群. 2018. 水稻鋅指蛋白基因OsBBX22響應(yīng)熱脅迫的功能分析[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學，37（2）：836-844. [Luo Y，Xie M，Zhang C，Wang W P，Zhu J H，Wan X Y，Wang Q M，Rao L Q. 2017. Function analysis of rice zinc finger protein gene OsBBX22 in response to heat stress[J]. Genomics and Applied Biology，37（2）：836-844.]

寧露云，李蓓，李佩，包滿珠，張蔚. 2014. 矮牽牛B-box型鋅指蛋白基因PhBBX8的克隆與表達分析[J]. 園藝學報，41（12）：2437-2445. [Ning L Y，Li B，Li P，Bao M Z，Zhang W. 2014. Cloning and expression analysis of a B-box-type zinc-finger protein gene PhBBX8 in Petunia hybrid[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（12）：2437-2445.]

騰海艷. 2020. 水稻Ossp1基因的亞細胞定位及其干旱條件下的表達[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，36（3）：529-534. [Teng H Y. 2020. Subcellular localization and expression under drou-ght conditions of rice Ossp1 gene[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，36（3）：529-534.]

王日紅，宋敏燕，王然，楊英杰. 2019. 山梨B-box基因PuBBX24表達特性及其在童期調(diào)控中的功能分析[J]. 園藝學報，46（8）：1458-1472. [Wang R H，Song M Y，Wang R，Yang Y J. 2019. Expression pattern and function in juvenile regulation of B-box gene PuBBX24 in Pyrus ussuriensis[J]. Acta Horticulturae Sinica，46（8）：1458-1472.]

向建華，李靈之，陳信波. 2012. 植物非生物逆境相關(guān)鋅指蛋白基因的研究進展[J]. 核農(nóng)學報，26（4）：666-672. [Xiang J H，Li L Z，Chen X B. 2012. Progress in the study of abio-tic stress-related zinc finger protein genes in plants[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，26（4）：666-672.]

姚琦園，李紛芬，張林成，周升恩. 2018. 植物MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控非生物脅迫的研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，30（5）：73-79. [Yao Q Y，Li F F，Zhang L C，Zhou S E. 2018. Research progress in MADS-box transcription factors involved in regulation of abiotic stress of plants[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（5）：73-79.]

曾露桂，羅倩，吳宇瑤，聶瓊. 2020. 煙草轉(zhuǎn)錄因子NtMYC2對激素及非生物因素脅迫的響應(yīng)[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報，54（3）：386-391. [Zeng L G，Luo Q，Wu Y Y，Nie Q. 2020.? Response of tobacco transcription factor NtMYC2 to hormone and abiotic stress[J]. Journal of Henan Agricultural University，54（3）：386-391.]

鄭曉瑜，郭晉艷，張毅，李秋莉. 2011. 植物非生物脅迫誘導啟動子順式作用元件的研究方法[J]. 植物生理學報，47（2）：129-135. [Zheng X Y，Guo J Y，Zhang Y，Li Q L. 2011. Research methods of cis-acting elements in plant abiotic stress inducible promoters[J]. Plant Physiology Journal，47（2）：129-135.]

朱建楚，布都會，于新智，王新中. 2003. Biolistic PDS-1000/He基因槍的使用方法[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，（6）81-82. [Zhu J C，Bu D H，Yu X Z，Wang X Z. 2003. The usage me-thod of Biolistic pds-1000/He gene gun[J]. Shaanxi Journal of Agricultural Sciences，（6）：81-82.]

Datta S，Hettiarachchi C，Johansson H，Holm M. 2007. SALT TOLERANCE HOMOLOG2，a B-box protein in Arabidopsis that activates transcription and positively regulates light-mediated development[J]. The Plant Cell，19（10）：3242-3255.

Datta S，Johansson H，Hettiarachchi C，Irigoyen M L，Desai M，Rubio V，Holm M. 2008. LZF1/SALT TOLERANCE HOMOLOG3，an Arabidopsis B-box protein involved in light-dependent development and gene expression，undergoes COP1-mediated ubiquitination[J]. The Plant Cell，20（9）：2324-2338.

Datta S，Hettiarachchi G H，Deng X W，Holm M. 2006. Arabidopsis CONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J]. The Plant Cell，18（1）：70-84.

Fan X Y，Sun Y，Cao D M，Bai M Y，Luo X M，Yang H J，Wei C Q，Zhu S W，Sun Y，Chong K，Wang Z Y. 2012. BZS1，a B-box protein，promotes photomorphogenesis downstream of both brassinosteroid and light signaling pathways[J]. Molecular Plant，5（3）：591-600.

Gangappa S N，Botto J F. 2014. The BBX family of plant transcription factors[J]. Trends Plant Science，19（7）：460-470.

Huang J Y，Zhao X B，Weng X Y，Wang L，Xie W B. 2012. The rice B-box zinc finger gene family：Genomic identification，characterization，expression profiling and diurnal analysis[J]. PLoS One，7（10）：e48242.

Indorf M，Cordero J，Neuhaus G，Rodríguez-Franco M. 2007. Salt tolerance（STO），a stress-related protein，has a major role in light signaling[J]. The Plant Journal，51（4）：563-574.

Jan A，Maruyama K，Todaka D，Kidokoro S，Abo M，Yoshimura E，Shinozaki K，Nakashima K，Yamaguchi-Shinozaki K. 2013. OsTZF1，a CCCH-tandem zinc finger protein，confers delayed senescence and stress tolerance in rice by regulating stress-related genes[J]. Plant Physiology，161（3）：1202-1216.

Khanna R，Kronmiller B，Maszle D R. 2009. The Arabidopsis B-box zinc finger family[J]. The Plant Cell，21（11）：3416-3420.

Kim S K，Yun C H，Lee J H，Jang Y H，Park H Y，Kim J K. 2008. OsCO3，a CONSTANS-LIKE gene，controls flowe-ring by negatively regulating the expression of FT-like genes under SD conditions in rice[J]. Planta，228（2）：355-365.

Liu K，Wang L，Xu Y，Chen N，Ma Q，Li F，Chong K. 2007. Overexpression of OsCOIN，a putative cold inducible zinc finger protein，increased tolerance to chilling，salt and drought，and enhanced proline level in rice[J]. Planta，226（4）：1007-1016.

Wang Q M，Tu X J，Zhang J H，Chen X B，Rao L Q. 2012. Heat stress-induced BBX18 negatively regulates the thermo tolerance in Arabidopsis[J]. Molecular Biology Reports，40（3）：2679-2688.

（責任編輯 陳 燕）