李審微 洪艷云 李新文 何可佳 戴良英 盧曉鵬 宋娜 易圖永

摘要：【目的】明確柑橘砂皮病不同發(fā)病等級(jí)及噴施生防菌枯草芽孢桿菌M-23后柑橘葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，揭示生防菌防治柑橘砂皮病的葉際微生物學(xué)機(jī)制，為進(jìn)一步研究柑橘砂皮病的生物防治提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā吭囼?yàn)設(shè)對(duì)照區(qū)和噴施生防菌區(qū)2個(gè)區(qū)域，噴施生防菌區(qū)分別在2019年3月中旬柑橘春梢長(zhǎng)2～3 cm、4月中旬、謝花2/3、果實(shí)蠶豆大小和果實(shí)乒乓球大小時(shí)噴施M-23菌株發(fā)酵液，噴藥液量3 L/株;同時(shí)對(duì)照區(qū)噴施等量的滅菌NB液體培養(yǎng)基，在最后一次噴施生防菌15 d 后進(jìn)行防效調(diào)查。采集噴施生防菌區(qū)柑橘葉片（R4處理，病情等級(jí)0級(jí)）和未噴施生防菌區(qū)不同發(fā)病等級(jí)的柑橘葉片（R1、R2和R3處理，病情等級(jí)分別為0、5和9級(jí)），使用FastDNA[?] Spin Kit for Soil試劑盒提取柑橘葉片葉際微生物總DNA，通過(guò)Illumina MiseqTM高通量平臺(tái)測(cè)序分析微生物群落多樣性?！窘Y(jié)果】生防菌M-23對(duì)柑橘砂皮病的防治效果達(dá)74.02%。高通量測(cè)序共獲得571091條序列，單一樣品序列數(shù)17833～96147條，在97%的相似水平下進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析聚類后獲得2932個(gè)OTUs。4個(gè)處理的OTUs數(shù)量分別為1944、1545、1205和607個(gè)，表現(xiàn)為R1>R2>R3>R4。在門水平的組成上主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）組成。變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌門，在R1、R2、R3和R4處理中的相對(duì)豐度分別為81.84%、87.93%、86.80%和68.82%。對(duì)照區(qū)的葉際微生物多樣性與發(fā)病等級(jí)成反比;噴施生防菌后柑橘葉片葉際細(xì)菌群落多樣性降低，在屬水平上芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對(duì)豐度得到明顯增加，芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度達(dá)33.41%。【結(jié)論】噴施生防菌M-23能有效防治柑橘砂皮病。M-23菌株能在柑橘葉片上定殖和增殖，改善葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提升有益菌的比例，使病情指數(shù)降低，具有一定的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 柑橘砂皮病;葉際細(xì)菌;生防菌;高通量測(cè)序;多樣性

中圖分類號(hào)： S436.66? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）07-1699-07

Abstract：【Objective】Focusing on different severities of Diaporthe citri and the shifts of bacterial community diversity in citrus phyllosphere after spraying with Bacillus subtilis M-23， this study was to reveal the phyllospheric microbiological mechanism of controlling D. citri with biocontrol bacteria and provide theoretical basis for further studies on biological control of D. citri. 【Method】The experiment was conducted in two areas—the control area and the treatment area. In the treatment area， biocontrol bacteria M-23 was sprayed in the middle of March， 2019， when the citrus spring tip grew 2-3 cm， in the middle of April，? 2/3 of flowers fell， the citrus size was like broad bean and the citrus size was like ping-pong ball， evenly onto citrus leaves with an inoculum of 3 L/plant. At the same time， the control area was sprayed with the same amount of sterilized NB medium. The control effect was investigated 15 d after the last application of biocontrol agents. Collecting leaves with different incidence grades in the sprayed areas（R4 treatment， incidence grade 0） and unsprayed areas（R1， R2 and R3 treatments，incidence grades 0， 5 and 9 respectively）. FastDNA[?] Spin Kit for Soil kit was used to extract the total DNA of phyllosphere microorganisms， and the diversity of? microbial community was analyzed by Illumina MiseqTM high throughput platform sequencing method. 【Result】The result showed that the control effect of biocontrol bacterium M-23 on D. citri was 74.02%. A total of 571091 high quality sequences were obtained by high throughput sequencing， the number of single sample sequences ranged from 17833 to 96147， and 2932 OTUs were obtained by bioinformatics statistical analysis clustering at a similar level of 97%. The number of OTUs of the four treatments were 1944， 1545， 1205 and 607， respectively，in the following order：R1>R2>R3>R4. The horizontal composition of the phylum was mainly composed of Proteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Actinomycetes， Fusobacteria， Armatimonadetes， Acidobacteria and Verruciformis. Proteobacteria were dominant， and the relative abundances in R1， R2， R3 and R4 treatments were 81.84%， 87.93%， 86.80% and 68.82%， respectively. In the control area，phyllosphere microbial diversity was inversely proportio-nal to the incidence level. After spraying the biocontrol agent， the diversity of the bacterial community in the phyllosphere decreased， and the relative abundance of Bacillus and Pseudomonas increased obviously at the genus level， the relative abundance of Bacillus reached 33.41%. 【Conclusion】To sum up， spraying M-23 can effectively prevent the occurrence of D. citri. M-23 can colonize and proliferate on citrus leaves， which improves the community structure of phyllosphere bacteria， increases the proportion of beneficial bacteria， and reduces the disease index. Therefore， B. subtilis M-23 has certain application potential.

Key words： Diaporthe citri; phyllosphere bacteria; biocontrol bacteria; high-throughput sequencing; diversity

Foundation item： Post Scientist Project of Modern Agriculture（Citrus） Industrial Technology System（CARS-26）; Citrus Plant Protection Post Expert of Hunan Fruit Industry Technology System（Xiangnongfa〔2015〕137）; Hunan Agricultural Universitys “Double First-Class” Construction Sub-project（SYL2019027）; Hunan Agricultural University Youth Science Foundation Project（19QN30）

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，柑橘砂皮病在湖南省大面積發(fā)生，且日益嚴(yán)重，給湖南省柑橘產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（馬靖艷等，2019）。柑橘砂皮病菌（Diaporthe citri）為弱寄生菌，在樹(shù)體受傷或樹(shù)勢(shì)衰弱時(shí)進(jìn)行侵染，特別是侵染葉片和果實(shí)，常在表面形成黑色麻點(diǎn)，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀和品質(zhì)，影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值（方天露，2017）。目前，防治柑橘砂皮病主要依靠化學(xué)藥劑防治，每年需進(jìn)行6次以上噴施才有較好的控制效果。大量化學(xué)藥劑的使用極易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗性和農(nóng)藥殘留，影響環(huán)境微生物的平衡（周娜等，2015）。生物防治措施因?qū)Νh(huán)境友好、安全程度高、不會(huì)造成藥物殘留而受到研究者們的重視。因此，研究柑橘砂皮病不同發(fā)病等級(jí)柑橘葉片葉際微生物多樣性，探究噴施生防菌對(duì)葉際微生物多樣性的影響，有助于從微生態(tài)分析中發(fā)現(xiàn)柑橘砂皮病病害與微生態(tài)之間的關(guān)系，明確芽孢桿菌對(duì)柑橘砂皮病的抗病機(jī)制，為防治柑橘砂皮病提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高爽等（2016）綜述了植物葉際微生物群落的組成、特點(diǎn)及與外界環(huán)境的互作，發(fā)現(xiàn)不同因素均會(huì)對(duì)葉際微生物群落組成造成一定影響，其變化有規(guī)律可循，微生物群落組成的改變會(huì)影響寄主植物的生長(zhǎng)?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用對(duì)植物葉際微生物群落的影響較大，謝蘭芬等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，使用百菌清處理玉米葉片對(duì)其葉際微生物的影響較大，而解淀粉芽孢桿菌與噴施環(huán)境兼容性良好，是一種生態(tài)、環(huán)境友好的防治手段。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，擴(kuò)增子測(cè)序分析技術(shù)逐漸在植物葉際微生物多樣性的研究中得到廣泛使用（Bodenhausen et al.，2013）。羅路云等（2017）比較了不同發(fā)病等級(jí)下植物葉際微生物種群的多樣性，發(fā)現(xiàn)由于病害的發(fā)生，植物葉際細(xì)菌種群會(huì)發(fā)生顯著變化，發(fā)病葉片葉際細(xì)菌多樣性明顯低于健康葉片葉際細(xì)菌多樣性。Zhang等（2008）研究蘇云金芽孢桿菌對(duì)微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)接種蘇云金芽孢桿菌后辣椒葉際微生物結(jié)構(gòu)受到影響，微生物多樣性降低。岑?。?016）將多粘類芽孢桿菌噴施在茶葉上，發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌可在葉際定殖，施用生防菌后在實(shí)現(xiàn)良好促生和病害抑制作用的基礎(chǔ)上減少了葉際細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，但對(duì)于群落的組成和體系的穩(wěn)定影響較小?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)柑橘砂皮病的研究主要集中在其發(fā)生規(guī)律和化學(xué)防治上，生物防治也僅限于基礎(chǔ)的生防菌篩選，沒(méi)有對(duì)柑橘砂皮病不同發(fā)病等級(jí)葉際細(xì)菌群落多樣性的差異性比較和施用生防菌發(fā)酵液后葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化方面的研究。生防菌M-23由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院園藝作物病害研究室篩選獲得，通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)其能抑制柑橘砂皮病病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，但未對(duì)其田間防治效果及對(duì)柑橘葉際微生物的影響進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)生防菌M-23對(duì)柑橘砂皮病防治的田間試驗(yàn)，利用高通量測(cè)序技術(shù)比較不同處理下柑橘葉際細(xì)菌群落多樣性的差異，探究生防菌防治柑橘砂皮病的機(jī)制，為柑橘砂皮病的生物防治提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試生防菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subti-lis）M-23，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院園藝作物病害研究室分離獲得。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于湖南省懷化市洪江市雙溪鎮(zhèn)柑橘園藝場(chǎng)，該橘園于1986年建園，品種為冰糖橙，柑橘砂皮病發(fā)生較重。

1. 2. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)對(duì)照區(qū)和噴施生防菌區(qū)2個(gè)區(qū)域。將生防菌M-23活化后以0.8%的接種量接種于滅菌的NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d后備用。噴施生防菌區(qū)分別在2019年3月中旬柑橘春梢長(zhǎng)2～3 cm、4月中旬、謝花2/3、果實(shí)蠶豆大小和果實(shí)乒乓球大小時(shí)噴施生防菌發(fā)酵液，使用人工背負(fù)式電動(dòng)噴霧器對(duì)葉片進(jìn)行噴灑，噴藥液量3 L/株;同時(shí)對(duì)照區(qū)以相同條件噴施等量的滅菌NB液體培養(yǎng)基。葉片采集設(shè)4個(gè)處理，其中對(duì)照區(qū)葉片采集根據(jù)柑橘砂皮病的病情等級(jí)（R1：0級(jí)，無(wú)病斑;R2：5級(jí)，每葉病斑51～75個(gè);R3：9級(jí)，每葉病斑100個(gè)以上）對(duì)應(yīng)設(shè)R1、R2和R3處理，噴施生防菌區(qū)設(shè)R4處理（葉片無(wú)病斑）。

1. 2. 3 樣品采集方法 最后一次噴施生防菌15 d后，從對(duì)照區(qū)選擇3株柑橘樹(shù)分別采集R1、R2和R3處理的柑橘葉片。葉片采集采用五點(diǎn)取樣法，每株柑橘樹(shù)于東西南北中各選擇1個(gè)枝條，每枝條采集R1處理同等大小柑橘葉片1片，每處理共15片葉混合放入無(wú)菌采樣袋中，進(jìn)行3次重復(fù)，共獲得3個(gè)樣品，分別命名為SP01、SP02和SP03;以同樣的方式采集R2和R3處理柑橘葉片樣品，R2處理的樣品命名為SP51、SP52和SP53，R3處理的樣品命名為SP91、SP92和SP93。從噴施生防菌區(qū)3棵不同柑橘樹(shù)上采集無(wú)病的柑橘葉片，方法同上，樣品命名為BS01、BS02和BS03。

1. 2. 4 防治效果調(diào)查 參照張?jiān)赖龋?018）的方法對(duì)柑橘砂皮病進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，無(wú)病;1級(jí)，葉片或果實(shí)上有1～25個(gè)病斑;3級(jí)：葉片或果實(shí)上有26～50個(gè)病斑;5級(jí)：葉片或果實(shí)上有51～75個(gè)病斑;7級(jí)：葉片或果實(shí)上有76～100個(gè)病斑;9級(jí)：葉片或果實(shí)上有100個(gè)病斑以上。收獲期間分別調(diào)查對(duì)照區(qū)和噴施生防菌區(qū)柑橘砂皮病病情指數(shù)并計(jì)算防治效果，每區(qū)調(diào)查3株柑橘樹(shù)，每株5個(gè)枝條，共調(diào)查15個(gè)枝條上葉片的發(fā)病情況。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查

總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）×100

防治效果（%）=（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-防治區(qū)病情

指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100

1. 2. 5 葉際微生物總DNA提取 取葉片6 g加入滅菌的錐形瓶中，向錐形瓶加入pH 7的0.1 mol/L PBS緩沖液100 mL、吐溫-80 100 ?L。錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩10 min后，在恒溫?fù)u床中以28 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)30 min，然后再次用超聲波振蕩器振蕩5 min，在無(wú)菌條件下用鑷子取出葉片。采用真空泵對(duì)錐形瓶中的液體進(jìn)行抽濾，用0.45 ?m微孔濾膜收集微生物。使用FastDNA[?] Spin Kit for Soil試劑盒提取葉際微生物DNA，要求DNA濃度和純度的A260/A280為1.8～2.0。

1. 2. 6 16S rDNA的V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序 第一輪擴(kuò)增，PCR引物為341F[5'-CCCTACACGACGCT CTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCA G-3']和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCG AGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。反應(yīng)體系30 ?L：2×Taq Master Mix 15 ?L，上、下游引物（10 μmol/L）各1 ?L，DNA模板10～20 ng，ddH2O補(bǔ)足至30 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);94 ℃預(yù)變性20 s;94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。第二輪擴(kuò)增，引物Illumina橋式PCR兼容引物。反應(yīng)體系30 ?L：2×Taq Master Mix 15 ?L，上、下游引物（10 μmol/L）各1 ?L，PCR產(chǎn)物20 ng（第一輪），ddH2O補(bǔ)足至30 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1. 3 數(shù)據(jù)處理與分析

Illumina MiseqTM平臺(tái)獲得的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)質(zhì)控過(guò)濾后剔除嵌合體和非特異性擴(kuò)增序列，得到的有效數(shù)據(jù)使用Usearc軟件以97%的默認(rèn)相似性將序列聚類成為一個(gè)OTU。以聚類similarity值（0.86～0.99）為橫坐標(biāo)、OTU數(shù)目變化（0～25000）為縱坐標(biāo)制圖，本研究OTU分析和分析學(xué)分析選擇的similarity值為0.97。使用97%相似度的OTU，用Mothur進(jìn)行Rarefaction分析（Asnicar et al.，2015），利用R制作稀釋曲線用來(lái)評(píng)估各樣品在測(cè)序強(qiáng)度間的差異。根據(jù)每個(gè)樣品文庫(kù)的OTU豐度信息，完成Alpha和Beta多樣性分析。計(jì)算Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)，評(píng)估序列文庫(kù)的多樣性。通過(guò)NMDS（Non-metric multidimensional scaling）分析4組不同處理微生物群落結(jié)構(gòu)間的差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 生防菌M-23對(duì)柑橘砂皮病的防治效果

由表1可知，對(duì)照區(qū)發(fā)病較嚴(yán)重，病情指數(shù)高達(dá)36.45;噴施生防菌區(qū)施菌后病情指數(shù)降低至9.47，防治效果明顯，防效達(dá)74.02%。說(shuō)明生防菌M-23對(duì)柑橘砂皮病具有較強(qiáng)的拮抗作用。

2. 2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

利用高通量測(cè)序共得到571091條有效序列，單一樣品序列數(shù)17833～96147條，平均為47591條，對(duì)序列在97%相似水平下進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，獲得2932個(gè)OTUs。采用稀釋曲線來(lái)比較樣品間物種的豐度和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的合理性，如圖1所示，Shannon指數(shù)的稀釋曲線趨于平緩，可認(rèn)為測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中絕大多數(shù)物種，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

2. 3 OTU聚類分析結(jié)果

由圖2可看出，R1、R2、R3和R4處理分別有1944、1545、1205和607個(gè)OTUs，4個(gè)處理間的OTUs數(shù)量表現(xiàn)為R1>R2>R3>R4，說(shuō)明未噴施生防菌且未發(fā)病的R1處理微生物種類最豐富，隨著病情指數(shù)的增加微生物種類豐富度隨之降低，噴施生防菌的R4處理微生物種類最少。

2. 4 Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果

目前，普遍認(rèn)可種（Species）的分類水平為97%序列相似度（Gu et al.，2019），在該相似度水平下使用獲取的OTU分析各樣品的Alpha多樣性，通過(guò)Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)對(duì)柑橘葉際微生物多樣性進(jìn)行評(píng)估，所得的參數(shù)如表2所示。由表2可知，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)的變化范圍分別為1.41～3.77、0.084～0.372、365.6～1256.5和413.7～1302.2。對(duì)噴施滅菌培養(yǎng)基的R1、R2和R3處理的Shannon指數(shù)進(jìn)行比較，表現(xiàn)為R1>R2>R3，表明微生物多樣性隨著病情指數(shù)的升高而降低;噴施生防菌的R4處理與噴施滅菌培養(yǎng)基的R1、R2和R3處理相比，噴施生防菌后Simpson指數(shù)顯著降低（P<0.05），與OTU聚類分析結(jié)果吻合。

2. 5 NMDS非度量多維尺度分析結(jié)果

根據(jù)非度量多維尺度分析結(jié)果（圖3），R2和R3處理與R1處理在坐標(biāo)軸上有一定距離，表明柑橘砂皮病的發(fā)生導(dǎo)致葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變;R4處理與R1、R2和R3處理距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明生防菌的加入改變了葉際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。如圖3所示，相同處理的重復(fù)能緊密靠在一起，不同處理間可明顯區(qū)分，各處理間有明顯差異性，相同處理間群落相似度較高，未噴施生防菌不同病情等級(jí)條件下的葉際細(xì)菌群落與生防菌處理的細(xì)菌群落可明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)。使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法Anosim做進(jìn)一步分析，根據(jù)分析結(jié)果（表3）可知，R接近1，說(shuō)明4個(gè)處理的組間差異大于組內(nèi)差異，P=0.011，小于0.05，說(shuō)明分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。

2. 6 高通量測(cè)序分析柑橘葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

柑橘葉際細(xì)菌群落門水平和屬水平在各分組樣品中相對(duì)豐度≥1%的組成情況見(jiàn)圖4和圖5。在門水平上主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）組成（圖4）。其中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在R1、R2、R3和R4處理中的相對(duì)豐度分別為81.84%、87.93%、86.80%和68.82%，噴施滅菌培養(yǎng)基處理的R1處理與R2和R3處理相比，變形菌門的相對(duì)豐度隨著病情等級(jí)升高而升高，R2處理與R3處理間無(wú)明顯差異，噴施生防菌后R4處理中變形菌門的相對(duì)豐度有所下降;發(fā)病后降低了浮霉菌門的相對(duì)豐度;噴施滅菌培養(yǎng)基處理組的厚壁菌門的相對(duì)豐度均在10.00%以下，而噴施生防菌后R4處理組厚壁菌門的相對(duì)豐度為34.89%，相對(duì)豐度明顯增加。

進(jìn)一步對(duì)各分組樣品在屬水平（OTU數(shù)相對(duì)豐度≥1%）的相對(duì)豐度進(jìn)行研究，結(jié)果（圖5）表明，不同樣品的主要葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和馬賽菌屬（Massilia）為R1、R2和R3處理的共有優(yōu)勢(shì)菌屬，黃單胞菌屬（Xanthomonas）為R2和R3處理的共有優(yōu)勢(shì)菌屬。橘園發(fā)病后假單胞菌屬的豐度降低，噴施生防菌后明顯上升，在R4處理組中達(dá)最高（42.79%）。鞘氨醇單胞菌屬和黃單胞菌屬在發(fā)病后相對(duì)豐度先明顯升高，然后略微下降，可能與致病菌存在協(xié)同作用。噴施生防菌后R4處理的細(xì)菌主要由假單胞菌屬和芽孢桿菌屬（Bacillus）組成，芽孢桿菌屬在R4處理中的相對(duì)豐度達(dá)33.41%，說(shuō)明M-23菌株在葉際得到較好的定殖。

3 討論

近年來(lái)，湖南省懷化地區(qū)由于降水增加、溫度上升、果農(nóng)對(duì)柑橘園管理不當(dāng)、化學(xué)農(nóng)藥濫用等導(dǎo)致柑橘砂皮病發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，給柑橘的品質(zhì)帶來(lái)嚴(yán)重影響（馬靖艷等，2019），造成重大經(jīng)濟(jì)損失。生物防治是防治柑橘砂皮病最有效的綠色防治措施，通常是在植物生長(zhǎng)的自然環(huán)境中獲得對(duì)病原菌有拮抗作用的生防菌株來(lái)防治病害，這種生物防治的方法可維持葉際微生物生態(tài)系統(tǒng)的平衡（Wang et al.，2019）。

植物病害的發(fā)生會(huì)影響其環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)變化，多樣性和均勻性隨著病害的發(fā)生而降低，化學(xué)農(nóng)藥的噴施會(huì)影響環(huán)境微生物的生態(tài)平衡，而生防菌可優(yōu)化環(huán)境微生物的組成（李春宏等，2019;李忠奎等，2019）。岑浴（2016）研究多粘類芽孢桿菌在茶葉上的定殖及其對(duì)葉際細(xì)菌群落的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，生防菌在葉片上定殖作為一種生物刺激，可改良葉際細(xì)菌的生態(tài)環(huán)境，并不會(huì)產(chǎn)生生物入侵的作用打破葉際微生物的生態(tài)平衡造成生態(tài)環(huán)境的紊亂。謝蘭芬等（2018）在生防菌對(duì)玉米葉際微生物影響的研究中證明殺菌劑嚴(yán)重降低了玉米葉際微生物的代謝活動(dòng)，而解淀粉芽孢桿菌與噴施環(huán)境兼容性良好。Zhang等（2008）探究黃瓜和辣椒的葉際使用蘇云金芽孢桿菌對(duì)其葉際微生物結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示蘇云芽孢桿菌會(huì)降低微生物的多樣性。本研究中R1處理（發(fā)病等級(jí)為0級(jí)）的Chao1、Shannon和ACE指數(shù)均大于其他處理，Simpson指數(shù)小于其他處理，在病害入侵后其葉際微生物多樣性和豐富度較健康葉際微生物有所降低;噴施生防菌的R4處理Chao1、Shannon和ACE指數(shù)的降低可能是因?yàn)楦涕偃~片噴施生防菌后，突然有大量生防菌加入，其他葉際微生物的定殖受到一定影響，從而提升了有協(xié)同作用菌群的相對(duì)豐度，抑制了部分菌群的定殖，因此導(dǎo)致葉際微生物的多樣性有所降低，與Zhang等（2008）的研究結(jié)果一致。

在葉際細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的組成中，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門是4個(gè)處理共有的菌門，變形菌門和厚壁菌門是其優(yōu)勢(shì)菌門，厚壁菌門在R4處理中所占的比例最高，為34.89%，明顯高于未噴施生防菌的R1、R2和R3處理，其原因是噴施生防菌后枯草芽孢桿菌M-23在葉際得到良好定殖，增加了生防菌株所屬門的相對(duì)豐度;變形菌門主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱，盡管變形菌門在不同物種葉際的相對(duì)豐度不一致，但均為葉際細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)門類，與Laforest-Lapointe和Whitaker（2019）對(duì)葉際細(xì)菌群落研究得出的結(jié)果一致。變形菌門中很多細(xì)菌對(duì)周邊環(huán)境的平衡起到重要作用，其中γ-變形菌綱中的假單胞菌屬在4個(gè)處理中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，與劉暢等（2020）測(cè)定的煙草葉際微生物多樣性的研究結(jié)果基本一致。隨著病原菌的侵染假單胞菌屬的相對(duì)豐度下降，噴施生防菌后抑制了病害的發(fā)生，其相對(duì)豐度明顯上升，遠(yuǎn)高于其他處理，推測(cè)是假單胞菌屬與噴施的生防菌M-23在葉際的互作對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用。沙月霞和沈瑞清（2019）研究發(fā)現(xiàn)，3種芽胞桿菌浸種處理顯著改變水稻根和莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高了假單胞菌屬的相對(duì)豐度，本研究結(jié)果與之一致。假單胞菌屬作為葉際微生物的組成，隨著病害的發(fā)生或生防菌的噴施其相對(duì)豐度發(fā)生變化，可能與植物防御病原物入侵有關(guān)。有研究表明，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）產(chǎn)生的生物活性分子（冠菌素Coronatine和一種蛋白酶體抑制劑Sy- ringolin A）能引起氣孔關(guān)閉，從而影響病原體進(jìn)入質(zhì)外體（Hunter et al.，2010）。Ko等（2014）分離得到的一株假單胞菌菌株THJ609-3對(duì)柑橘砂皮病有較好的防效，可抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。此前也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種生防菌聯(lián)合使用可提高對(duì)病害的防治效果，譙天敏等（2015）將銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）與長(zhǎng)枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）2種生防菌聯(lián)合使用，對(duì)雜交竹梢枯病的協(xié)同防效得到顯著提高;Wang等（2019）使用枯草芽孢桿菌和哈茨木霉組成的生物產(chǎn)物能有效防治馬鈴薯瘡痂病。因此，芽孢桿菌屬與假單胞菌屬聯(lián)合使用以有效防治柑橘砂皮病有待進(jìn)一步探究。

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)柑橘葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，比較柑橘砂皮病不同發(fā)病等級(jí)下葉際細(xì)菌群落組成的區(qū)別和噴施生防菌后葉際菌群的變化，有助于深層次了解柑橘健康葉片與砂皮病葉的微生態(tài)差異，為研究柑橘砂皮病的防治提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

噴施生防菌M-23能有效防治柑橘砂皮病。在柑橘砂皮病發(fā)生較嚴(yán)重的柑橘園中噴施生防菌M-23后，M-23菌株能在柑橘葉片上定殖和增殖，改善葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提升有益菌的比例，使病情指數(shù)降低，具有一定的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）