賀繼剛 王梓豪 李敏 謝巧麗 毛富剛

云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院1心臟大血管外科，2心血管內(nèi)科（昆明650032）

冠狀動脈硬化性心臟?。╟oronary arteriosclerotic heart disease，CAD）引起的心肌梗死（myocardial infarction，MI）已成為世界疾病譜中的頭號“殺手”。目前對此危險因素的研究雖有一定進(jìn)展，但仍無法對其進(jìn)行有效的治療［1-3］。至今，對冠心病引起的心梗治療的中心為對心梗區(qū)域心肌細(xì)胞的保護(hù)，而目前生物治療走在了前方。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是生物治療的主要手段［4-6］。GATA-4是調(diào)控心臟基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，并可以抗心肌細(xì)胞凋亡［7-10］。外泌體（exosome）是由細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層囊泡狀物質(zhì)，其內(nèi)含有的miRNA 是其主要生物學(xué)功能分子，其可隨exosome 遠(yuǎn)距離運輸，并釋放入“受體”細(xì)胞，而改變受體細(xì)胞生物學(xué)功能［11-15］。結(jié)合以上研究背景，課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GATA-4 的BMSC 分泌的exosome（BMSCGATA-4-exosome）能夠通過減少心肌細(xì)胞凋亡壞死，進(jìn)而改善心梗后心功能。并證明在BMSCGATA-4-exosome 中miRNA-330-3p 表達(dá)明顯增高，提示其是BMSCGATA-4-exosome抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心梗后心功能的關(guān)鍵分子［16］。前期在BMSC體系內(nèi)過表達(dá)miRNA-330-3p并提取分泌的外泌體（BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome）與心肌細(xì)胞在低氧無血清下共培養(yǎng)，其可以明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率。且miRNA-330-3p 在心肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。進(jìn)一步根據(jù)miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-330-3p 對應(yīng)靶基因為Ap2m1、Cnot4，通過Western blot 證實Ap2m1 蛋白表達(dá)呈規(guī)律性降低，且與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本實驗力圖進(jìn)一步通過建立小鼠心梗模型，采用尾靜脈注射各組exosome，對miRNA-330-3p/Ap2m1軸在BMSCGATA-4-exosome 抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行體內(nèi)解析驗證。exosome 取代干細(xì)胞促進(jìn)心肌修復(fù)，不僅能實現(xiàn)無細(xì)胞修復(fù)，且降低了干細(xì)胞注入后對全身造成的影響，為exosome 成為心肌梗死治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物37 只雄性C57BL/6 小鼠，購自成都達(dá)碩（SCXK（川）2015—030）。所有動物實驗均已獲得云南省第一人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（YS2018872）。

1.1.2 主要試劑和儀器miRNA-330-3p inhibitor試劑（廣州銳博生物科技有限公司），miRNA-330-3p mimic 試劑（廣州銳博生物科技有限公司），DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco 公司），提取exosome 試劑盒（廣州銳博科技公司），Bulge-Loop miRNA qRTPCR Starter Kit（廣州銳博科技公司），cel-miR-39 引物、miRNA-330-3p 引物（廣州銳博科技公司），Ap2m1 一抗（上海市玉博科技公司），Cnot4 一抗（上海市玉博科技公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠BMSC 分離、培養(yǎng)及鑒定小鼠脛骨全骨髓法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，至干細(xì)胞到達(dá)第3 代（P3）時收集細(xì)胞采用CD11b 磁珠負(fù)選，去除造雜細(xì)胞。繼續(xù)干細(xì)胞培養(yǎng)傳至第7 代（P7）。待細(xì)胞匯合達(dá)90%時。完成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞三系分化檢測（三系分化按Cyagen Biosciences 公司分化試劑盒說明書操作）。

1.2.2 BMSCGATA-4通過采用基因開啟技術(shù)及病毒載體進(jìn)行構(gòu)建在慢病毒質(zhì)粒GV308中導(dǎo)入GATA-4 mRNA，構(gòu)建重組慢病毒包裝質(zhì)粒。并轉(zhuǎn)染入小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中需要時加入基因開啟劑強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DOX）使GATA-4 基因表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞的分組及處理準(zhǔn)備BMSC-exosome（5 μg/mL），BMSC空載體-exosome（5 μg/mL），BMSCGATA-4-exosome（5 μg/mL），BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome（5 μg/mL），BMSCmiRNA-330-3p-inhibitor-exosome（5 μg/mL）經(jīng)尾靜脈注射入心梗小鼠體內(nèi)，并將心梗未處理組、正常小鼠作為對照組（每組5 只）。

1.2.4 小鼠心肌梗死模型的建立采用水合氯醛（4%，0.1 mL/10 g）麻醉小鼠。直視下氣管插管并連接呼吸機(jī)，左側(cè)三肋間入胸，以9/0 縫線于左心耳根部下方。可見左心室前壁及心尖周圍心肌組織運動減弱，關(guān)閉肋間隙。模型制作完成后，觀察模型小鼠48 h，確保模型小鼠可以存活，用于后續(xù)實驗［16］。本實驗共應(yīng)用小鼠37 只，存活36 只，由于心衰死亡1 只（死于模型制作48 h 以內(nèi)）。小鼠心梗模型制作的成功率為95%。

1.2.5 心臟彩超將BMSC-exosome（5 μg/mL），BMSC空載體-exosome（5 μg/mL），BMSCGATA-4-exosome（5 μg/mL），BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome（5 μg/mL），BMSCmiRNA-330-3p-inhibitor-exosome（5 μg/mL）在小鼠心梗模型建模后48 h時經(jīng)尾靜脈注射入體內(nèi)，注射exosome的量為5 μg/mL，300 μL exosome，并將心梗未處理組、正常小鼠作為對照組（每組5 只）。于注射后48 h（前期已經(jīng)證明在給予BMSCGATA-4-exosome后48 h 心梗心功能的改善開始出現(xiàn)［16］）采用心臟彩超（PHILIPS EPIQ 7C）評估心功能改變。

1.2.6 RT-PCR取相同部位相同重量心肌組織，采用RT-PCR 方法檢測下述各組BMSC-exosome組，BMSC空載體-exosome 組，BMSCGATA-4-exosome 組，BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome 組、BMSCmiRNA-330-3p-inhibitor-exosome 組及心梗未處理組、正常小鼠，心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-330-3p 表達(dá)的量。

提取各組總RNA，將miRNA-330-3p逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。在對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增（95 ℃，10 min；95 ℃，2 s ；60 ℃，20 s；70 ℃，10 s），進(jìn)行分析。

1.2.7 利用TUNEL技術(shù)評估心梗部位心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量小鼠心梗模型建立48 h后給予注射BMSCexosome組，BMSC空載體-exosome組，BMSCGATA-4-exosome組，BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome 組、BMSCmiRNA-330-3p-inhibitorexosome 組的exosome，并將心梗未處理組及正常小鼠組作為對照組，評估心梗部位心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量（每組五只小鼠，取相同部位心臟組織，× 40倍，計數(shù)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量）。

1.2.8 靶基因預(yù)測對miRNA-330-3p 利用十二個小分子RNA 靶基因預(yù)測Database 進(jìn)行預(yù)測（條件：相同靶基因存在于≥10 個數(shù)據(jù)庫同時靶基因和小分子RNA 匹配度≥8），提示Ap2m1、Cnot4 為miRNA-330-3p 靶基因。

1.2.9 Western blot用蛋白免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)Ap2m1、Cnot4 蛋白的表達(dá)。提取體內(nèi)各組心梗部位心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，評估其細(xì)胞內(nèi)Ap2m1、Cnot4 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 15.0 統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較，統(tǒng)計假設(shè)檢驗為雙側(cè)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSC 3 系分化結(jié)果見圖1。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3 系分化圖Fig.1 Mouse BMSC three-line differentiation

2.2 構(gòu)建BMSCGATA-4 24 h 后采用RT-PCR 檢測GATA-4的表達(dá)BMSCGATA-4組較對照組其GATA-4基因表達(dá)增加97.27 倍，較對照組明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC 后24 h GATA-4 的RT-PCRFig.2 RT-PCR of GATA-4 24 h after lentivirus transfection of BMSC

2.3 心功能改變采用心臟彩超（PHILIPS EPIQ 7C）評估心功能改變，每組共5 只小鼠，共3 次，見圖3。

圖3 心梗模型建立48 h 后給予exosome 48 h 處理后射血分?jǐn)?shù)評價Fig.3 Ejection fraction was evaluated after 48 hours of exosome treatment after myocardial infarction model was established

2.4 miRNA-330-3p 的表達(dá)采用RT-PCR 定量評估各組心肌細(xì)胞中miRNA-330-3p 的表達(dá)，見圖4。

2.5 利用TUNEL 技術(shù)評估心梗部位心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量小鼠心梗模型建立48 h 后給予注射BMSC-exosome 組、BMSC空載體-exosome 組，BMSCGATA-4-exosome 組、BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome 組、BMSCmiRNA-330-3p-inhibitor-exosome 組的exosome，并將心梗未處理組及正常小鼠組作為對照組，每組5 只小鼠，取相同部位心臟組織，× 40 倍，計數(shù)心肌凋亡細(xì)胞，評估心梗部位心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量（以一批為例展示），見圖5。每組5 只小鼠，取相同部位心梗組織，高倍鏡下觀察各實驗組及對照組心臟梗死區(qū)凋亡細(xì)胞量，見圖6。

2.6 心梗心肌細(xì)胞Ap2m1、Cnot4 表達(dá)水平BMSCmiRNA-330-3p-mimic-exosome 組中心梗心肌細(xì)胞內(nèi)Ap2m1的表達(dá)規(guī)律性降低，且與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但Cnot4 表達(dá)未見規(guī)律性。見圖6、7。

圖4 心梗模型建立48 h 給予干預(yù)措施48 h 后心梗組織中miR-330-3p 表達(dá)Fig.4 miRNA-330-3p expression in myocardial infarction tissues 48 hours after myocardial infarction model was established and intervention was administered

圖5 各組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量（×40）Fig.5 Cardiomyocyte apoptosis each group（×40）

3 討論

結(jié)合目前國內(nèi)外研究結(jié)果，前期課題組發(fā)現(xiàn)BMSCGATA-4-exosome 能減少心肌細(xì)胞凋亡壞死，進(jìn)而提高心梗后心功能［16］。同時可見在exosome 中miRNA-330-3p 表達(dá)增高，提示其可能是BMSCGATA-4-exosome 改善心梗后心功能的關(guān)鍵分子。

microRNAs（miRNAs）為小分子非編碼RNA。成熟的miRNA 主要通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合而降解或抑制mRNA 的轉(zhuǎn)錄或翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞很多方面的功能，包括調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化和細(xì)胞應(yīng)激［17］。在人類中，編碼miRNAs 的基因只占基因的3%左右，但它們對大約30%的蛋白質(zhì)的表達(dá)都具有調(diào)節(jié)作用［18］。許多研究表明miRNA 可以在多種腫瘤中異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNAs 可能通過調(diào)節(jié)多種抑癌基因或致癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)展［19］。而miR-330-3p 是在文獻(xiàn)中經(jīng)常被描述的一類miRNA［20-21］。

圖6 心梗模型建立48 h 后給予干預(yù)措施處理后心梗局部細(xì)胞凋亡數(shù)量Fig.6 Myocardial infarction model is established after 48 hours and after the intervention measures to deal with the local number of apoptosis

圖7 心梗心肌細(xì)胞在48 h Ap2m1 及Cnot4 表達(dá)水平Fig.7 The expression levels of Ap2m1 and Cnot4 in myocardial cells of myocardial infarction at 48 h

圖8 心梗模型建立48 h 給予干預(yù)措施48 h 后心梗組織中Ap2m1、Cnot4 表達(dá)Fig.8 Ap2m1 and Cnot4 expression were observed in myocardial infarction 48 h after intervention

miR-330-3p 是WEBER 首次發(fā)現(xiàn)的，Has-miR-330位于人類染色體19q13.32［22］。miR-330-3p 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在乳腺癌［23］、食道癌［24］中表達(dá)上調(diào)。通過研究表明miR-330-3p 在以上腫瘤中可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在乳癌中如用miR-330-3p 轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞可減少G1 群體并促進(jìn)了細(xì)胞存活［25］。在食管癌中，F(xiàn)ACS研究表明，具有高miR-330-3p水平的食管上皮癌細(xì)胞具有較低比例的G0/G1 細(xì)胞。過表達(dá)和敲除實驗顯示，miR-330-3p水平與CDK 6和cyclinA水平呈正相關(guān)，與p21Waf1/Cip 1和p27Kip1水平呈負(fù)相關(guān)。CDK 6 和cyclinA 在DNA 合成前出現(xiàn)在G1 期，是S期進(jìn)入和通過G2/M 期所必需的［26］。本實驗通過建立小鼠心梗模型，發(fā)現(xiàn)BMSCmiRNA-330-3p-mimicexosome組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，符合上述實驗結(jié)果。進(jìn)一步采用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miRNA-330-3p 的靶基因進(jìn)行檢測，提示Ap2m1、Cnot4 為miRNA-330-3p靶基因。筆者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ap2m1表達(dá)具有明顯的規(guī)律性，而Cnot4 規(guī)律性不明顯。HELBIG 等［27］報道，AP2m1 變異是發(fā)育性和癲癇性腦病基礎(chǔ)，Ap2m1 編碼銜接蛋白復(fù)合物2（AP-2）的μ亞基參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）和突觸小泡回收。Ap2m1蛋白的變異缺失，導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡減少，異常增殖增加。此外據(jù)LE DUFF等［28］報道，細(xì)胞在誘導(dǎo)凋亡中AP2m1 的表達(dá)是上調(diào)的，與本研究結(jié)果一致。近幾年國內(nèi)外學(xué)者的研究側(cè)重放在BMSC、GATA-4 以及exosome 修復(fù)受損心肌三者獨立發(fā)揮的作用，而關(guān)于BMSCGATA-4-exosome 通過miRNA-330-3p/Ap2m1 軸抑制心肌細(xì)胞凋亡從而修復(fù)心肌損傷的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究尚無報道。本研究前期實驗結(jié)果作為立項依據(jù)，將首次明確BMSCGATA-4-exosome 在心肌損傷修復(fù)中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但據(jù)MIKULA 等［29］報道：通過對內(nèi)質(zhì)小體內(nèi)化過程進(jìn)行干擾，可致EGFR 數(shù)量增加，在抗凋亡過程中EGFR/ERK 途徑被激活。課題組將在后續(xù)實驗中檢測EGFR的表達(dá)。并進(jìn)一步設(shè)立多個研究時間點，探討miRNA-330-3p/Ap2m1 軸的時量變化。

綜上所述，miRNA-330-3p/Ap2m1軸是BMSCGATA-4-exosome 抗心肌細(xì)胞凋亡壞死的關(guān)鍵分子軸。