張慧超，譚 奎，葛 琳，劉 丹，閆麗麗，劉 文，喬 華，解 軍

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)a. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，b. 出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030001；2. 中國(guó)科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所煤轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030001)

碳量子點(diǎn)(簡(jiǎn)稱碳點(diǎn)，CDs)是一種粒徑約為10 nm的新型碳納米材料，形狀為準(zhǔn)球型[1-2]。研究[3-5]表明，CDs特殊的光學(xué)特性和優(yōu)良的生物學(xué)性能使其在分析檢測(cè)、藥物傳輸及生物成像等方面具有良好的發(fā)展前景。近期，陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)的出現(xiàn)更拓寬了CDs的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍。如Guo等[6]將CDs共摻雜N、S元素后，能得到表面電位為+20.29 mV的CCDs，可作為比率型熒光探針檢測(cè)目標(biāo)DNA。Zhou等[7]以海藻酸鈉為碳源，將制得的CCDs用作磷酸化轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β受體1(PTGF-β1)的載體轉(zhuǎn)染3T6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于常見的基因載體脂質(zhì)體2000和聚乙烯亞胺(PEI)。

隨著CDs在生物領(lǐng)域應(yīng)用范圍的不斷拓展，它與血漿蛋白的作用研究越來(lái)越受到業(yè)界的廣泛關(guān)注[8-10]。在生物材料與蛋白作用的眾多研究方法中，光譜分析法是一種常用且簡(jiǎn)便、可靠的分析手段。人體纖維原蛋白(human fibrinogen，hFIB)是一種由肝臟合成的具有凝血功能的可溶性血漿蛋白，分子量為340 ku，含有2 964個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為5.5[11]。因?yàn)楹?2個(gè)色氨酸殘基，所以hFIB具有很強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，常采用內(nèi)源熒光光譜并輔以圓二色譜進(jìn)行構(gòu)象變化研究。如蔡建周等[12]采用熒光發(fā)射光譜結(jié)合紫外光譜和圓二色光譜，研究了聚賴氨酸與hFIB的相互作用。Qiao等[13]利用內(nèi)源性和外源性熒光光譜結(jié)合圓二色光譜，考察了陽(yáng)離子與中性表面活性劑等摩爾復(fù)配體系對(duì)hFIB構(gòu)象的影響?？傊?，采用多光譜聯(lián)用技術(shù)能有效檢測(cè)CCDs與hFIB的相互作用，但是相關(guān)研究?jī)?nèi)容鮮有報(bào)道。

本文中利用蔗糖和谷氨酸為碳源，PEI為鈍化劑，制備CCDs，并利用透射電子顯微鏡、紅外光譜、X射線光電子能譜、納米激光粒度儀、紫外光譜和熒光光譜等對(duì)CCDs進(jìn)行形貌和結(jié)構(gòu)表征，研究CCDs與hFIB相互作用機(jī)理，探討CCDs對(duì)hFIB構(gòu)象的影響，以及兩者相互作用的規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

主要儀器包括：JEM-2100F型高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)，日本電子株式會(huì)社；Varian FTIR-640型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)，美國(guó)瓦里安有限公司；Maldi-TOF-MS型質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；UV-1200型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器公司；ESCALAB 250Xi 型X射線光電子能譜儀(XPS)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Cary Eclipse型熒光光譜儀，美國(guó)瓦里安有限公司；Zetasizer Nano ZS型納米激光粒度儀，英國(guó)馬爾文公司；圓二色光譜儀，法國(guó)Bio-Logic公司；AUY120 型電子分析天平，日本島津公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明醫(yī)療儀器公司。

主要試劑包括：hFIB(美國(guó)Bio Basic公司)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中，濃度為0.05 μmol/L，4 ℃溫度條件下冷藏，備用；蔗糖、谷氨酸、PEI 2000(Solarbio公司，分析純)。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 CCDs的制備與表征

1.2.1 制備

將蔗糖和谷氨酸按照質(zhì)量比10∶1混合，加入適當(dāng)比例的PEI 2000，用30 mL蒸餾水充分溶解后，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在200 ℃溫度條件下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，得到黃棕色溶液，取出后超聲振蕩30 min，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min的條件下離心分離15 min，取上清液，用截留分子量為1 000 u的透析袋透析純化24 h，得CCDs棕黃色溶液，冷凍干燥后制得CCDs棕色固體粉末，在4 ℃溫度條件下貯存，備用。

1.2.2 表征

采用質(zhì)譜儀測(cè)得合成CCDs的平均相對(duì)分子質(zhì)量為1 000。稱取少量CCDs 粉末，溶于超純水中得到CCDs溶液，于納米激光粒度儀上測(cè)定CCDs溶液表面電位。將CCDs溶液滴加于超薄碳膜銅網(wǎng)上，晾干；在加速電壓100 kV時(shí)，用TEM觀察CCDs 微觀形貌。取少量CCDs粉末，用溴化鉀(KBr)壓片法制樣，利用紅外光譜儀考察其紅外吸收特征。另取少量CCDs粉末進(jìn)行XPS能譜測(cè)試，考察其表面功能團(tuán)類型。

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定CCDs溶液的紫外-可見吸收光譜，以硫酸奎寧為參比，計(jì)算CCDs 的熒光量子產(chǎn)率。利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為300～500 nm時(shí)，每隔20 nm測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)CCDs的熒光發(fā)射光譜。

1.3 CCDs與hFIB相互作用的表征

1.3.1 熒光光譜和同步熒光光譜

準(zhǔn)確移取3.0 mL濃度為0.05 μmol/L的hFIB溶液置于石英比色皿中，采用熒光滴定法，依次滴加CCDs溶液(濃度為0.3 mmol/L)，在預(yù)先設(shè)定溫度(熱力學(xué)溫度分別為297、304、310 K)條件下，考察激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度都為10.0 nm時(shí)，體系在發(fā)射波長(zhǎng)為300～400 nm時(shí)的熒光發(fā)射光譜。設(shè)波長(zhǎng)間距Δλ分別為15、60 nm，考察hFIB與CCDs作用的同步熒光光譜。

1.3.2 圓二色光譜

在室溫條件下，以PBS緩沖液(pH=7.4)為空白扣除溶劑吸收峰，掃描CCDs與hFIB混合體系在波長(zhǎng)為200～250 nm時(shí)的圓二色光譜，設(shè)定掃描速度為60 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 CCDs的表征

采用HRTEM觀察CCDs的形貌特征，對(duì)其粒徑大小和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1所示。利用FTIR對(duì)合成的CCDs進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，如圖2所示。

(a)透射電子顯微鏡圖像

(b)高分辨率透射電子顯微鏡圖像

(c)粒徑分布圖1 陽(yáng)離子碳點(diǎn)的透射電子顯微鏡圖像和粒徑分布

圖2 陽(yáng)離子碳點(diǎn)的紅外光譜

(a)XPS全譜(b)C 1s能譜(c)N 1s能譜(d)O 1s能譜圖3 陽(yáng)離子碳點(diǎn)的X射線光電子能譜(XPS)圖

圖4 陽(yáng)離子碳點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜

圖5 陽(yáng)離子碳點(diǎn)的激發(fā)依賴熒光光譜

Zeta電位測(cè)試結(jié)果顯示，CCDs的Zeta電位為+28.7 mV，說(shuō)明其表面帶正電荷。而hFIB(等電點(diǎn)為5.5)在模擬生理?xiàng)l件(pH=7.4)時(shí)帶負(fù)電荷，因此，理論上推測(cè)CCDs可以與hFIB通過靜電作用力結(jié)合。

2.2 CCDs與hFIB作用研究

2.2.1 CCDs對(duì)hFIB的猝滅機(jī)理

hFIB分子中的72個(gè)色氨酸殘基賦予其很強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm時(shí)，在波長(zhǎng)為300～400 nm處能觀察到CCDs有很強(qiáng)的熒光發(fā)射；而CCDs在激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm時(shí)發(fā)射的熒光很弱，因此可利用hFIB的內(nèi)源性熒光變化考察CCDs與hFIB之間的作用規(guī)律。CCDs的濃度不同時(shí)hFIB的熒光光譜如圖6所示。從圖中可以看出，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm時(shí)，hFIB在波長(zhǎng)338 nm處有最大發(fā)射峰，而CCDs在這種情況下的熒光很弱(見圖5)，不會(huì)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的測(cè)量產(chǎn)生影響。隨著CCDs濃度增加，hFIB的最大熒光發(fā)射峰由波長(zhǎng)338 nm藍(lán)移至335 nm，并伴隨著熒光強(qiáng)度的逐漸減弱，說(shuō)明在CCDs的影響下，hFIB表面氨基酸殘基疏水性能減弱，原因可能是其與CCDs的結(jié)合引起本身構(gòu)象發(fā)生變化。

曲線1—12對(duì)應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。圖6 陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)對(duì)人體纖維原蛋白的熒光猝滅光譜

為了進(jìn)一步研究CCDs對(duì)hFIB的熒光猝滅作用機(jī)理，對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)采用Stern-Volmer動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行分析，即

(1)

式中：F0為未加CCDs時(shí)hFIB的熒光強(qiáng)度；F為加入CCDs后hFIB的熒光強(qiáng)度；c為CCDs的濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

不同濃度的CCDs與 hFIB作用的Stern-Volmer動(dòng)力學(xué)關(guān)系見圖7。由圖可知： 在熱力學(xué)溫度分別為297、304、310 K，CCDs的濃度為0～2.0 μmol/L時(shí)，F(xiàn)0/F與CCDs濃度呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度升高,KSV逐漸減小，說(shuō)明CCDs對(duì)hFIB的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是生成CCDs與hFIB復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[16]；當(dāng)CCDs的濃度大于2.0 μmol/L時(shí)，Stern-Volmer方程的斜率增大，表明CCDs與hFIB中的色氨酸殘基作用增強(qiáng)，原因可能是hFIB有72個(gè)色氨酸殘基，其構(gòu)象的改變(圓二色結(jié)果可證明)會(huì)導(dǎo)致包埋的色氨酸殘基裸露出來(lái)，增加與外源性物質(zhì)作用的機(jī)會(huì)。

F0—未加CCDs時(shí)hFIB的熒光強(qiáng)度； F—加入CCDs后hFIB的熒光強(qiáng)度。圖7 不同濃度的陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)與人體纖維原蛋白作用的Stern-Volmer動(dòng)力學(xué)關(guān)系

利用修正的Stern-Volmer方程可以考察濃度為0～2.0 μmol/L時(shí)CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka，

(2)

式中fa為熒光接近分?jǐn)?shù)。

CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka計(jì)算結(jié)果見表1。在CCDs的濃度為0～2.0 μmol/L的線性范圍內(nèi)，CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka與KSV變化趨勢(shì)相同：當(dāng)溫度升高時(shí)，結(jié)合常數(shù)Ka減小，說(shuō)明升高溫度會(huì)使CCDs與hFIB形成復(fù)合物(CCDs-hFIB)穩(wěn)定性降低，物質(zhì)間作用的強(qiáng)度減弱，符合靜態(tài)猝滅的特點(diǎn)。

2.2.2 CCDs與hFIB的結(jié)合作用力

小分子和生物大分子間的作用力通常包括范德華力、氫鍵、靜電作用力和疏水作用力等，具體作用力的類型可根據(jù)兩者相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷[17]。本文中通過式(3)—(5)計(jì)算CCDs與hFIB作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溫度時(shí)陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)與人體纖維原蛋白(hFIB)相互作用的猝滅常數(shù)KSV及相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)

(3)

ΔG=-RTlnKa,

(4)

(5)

式中：ΔG為吉布斯自由能變，kJ/mol；ΔH為焓變, kJ/mol；ΔS為熵變, J/(mol·K)；T為反應(yīng)溫度，K；R為氣體摩爾常數(shù)。通過lnKa對(duì)1/T作圖，可以得到一條直線，由直線的斜率可以計(jì)算出ΔH，由直線的截距可以求出ΔS。

由表1可以看出：CCDs與hFIB結(jié)合時(shí)ΔG<0，說(shuō)明CCDs與hFIB的結(jié)合作用是自發(fā)進(jìn)行的；由ΔH<0、ΔS>0可知，CCDs與hFIB結(jié)合時(shí)的作用力主要是靜電作用力，驗(yàn)證了2.1節(jié)中CCDs與hFIB以靜電結(jié)合的推測(cè)。

2.2.3 CCDs對(duì)hFIB構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化會(huì)引起蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的變化，甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)分子活性的改變和喪失。CCDs對(duì)hFIB二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響可以通過圓二色光譜和同步熒光光譜進(jìn)行考察[18]。

2.2.3.1 圓二色光譜

圓二色光譜是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的常用方法之一。圖8所示為CCDs與hFIB作用的圓二色光譜。從圖中可以看出，hFIB在波長(zhǎng)為208、222 nm處有2個(gè)負(fù)峰，表明hFIB具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[19]。當(dāng)加入的CCDs濃度逐漸增大時(shí)，hFIB的圓二色光譜橢圓率先減小后增大，但譜線形狀基本不變。這一結(jié)果說(shuō)明低濃度CCDs(1.0 μmol/L)能引起hFIB的α-折疊程度增強(qiáng)，α-螺旋度由起始的16.5%增加到36.0%；當(dāng)CCDs的濃度大于1.0 μmol/L時(shí)，又會(huì)使得hFIB分子解螺旋，α-螺旋度由起始的16.5%分別減小到6.80%(CCDs的濃度為2.0 μmol/L)、3.10%(CCDs的濃度為3.0 μmol/L)和-2.38%(CCDs的濃度為5.0 μmol/L)，α-螺旋度可參考文獻(xiàn)[20]中的方法計(jì)算。由此可知，CCDs的濃度增大時(shí)對(duì)蛋白的構(gòu)象影響很大，甚至使蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失，因此為了保證蛋白的生理功能，CCDs應(yīng)當(dāng)在較低濃度(<1.0 μmol/L)范圍內(nèi)使用。

曲線1—6對(duì)應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 μmol/L。圖8 不同濃度的陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)與人體纖維原蛋白作用的圓二色光譜

2.2.3.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜是蛋白構(gòu)象變化的常用分析方法，能夠反映蛋白質(zhì)分子中酪氨酸(Δλ=15 nm)和色氨酸(Δλ=60 nm)殘基的特征信息。CCDs與hFIB作用的同步熒光光譜如圖9所示。由圖9(a)、(b)可以看出，加入CCDs后，hFIB的酪氨酸發(fā)射峰由波長(zhǎng)292 nm藍(lán)移至290 nm，色氨酸殘基的熒光發(fā)射峰從波長(zhǎng)279 nm紅移到281 nm，說(shuō)明CCDs與hFIB 結(jié)合后，hFIB分子的疏水微環(huán)境改變，即酪氨酸殘基周圍的疏水性增強(qiáng)，色氨酸殘基周圍的疏水性減弱，使得該蛋白的構(gòu)象變得較為疏松。同時(shí)，hFIB的同步熒光峰強(qiáng)度都呈現(xiàn)逐步減小的趨勢(shì)，但減小的幅度不同。圖9(c)顯示，在任意相同濃度下，酪氨酸殘基的熒光強(qiáng)度減小幅度顯著低于色氨酸殘基的，說(shuō)明CCDs與hFIB的色氨酸殘基作用更強(qiáng)，對(duì)其影響更大。同步熒光猝滅率RSFQ為

曲線1—12對(duì)應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(a)酪氨酸殘基

曲線1—12對(duì)應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(b)色氨酸殘基

(c)同步熒光猝滅率圖9 不同濃度的陽(yáng)離子碳點(diǎn)(CCDs)與人體纖維原蛋白(hFIB)作用的同步熒光光譜

(6)

式中FSF0、FSF分別為不存在、存在不同濃度CCDs時(shí)血清蛋白的同步熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)語(yǔ)

本文中利用一步水熱法制備了帶正電荷的CCDs，利用熒光猝滅、同步熒光和圓二色光譜考察了CCDs與hFIB的相互作用。CCDs對(duì)hFIB產(chǎn)生明顯的熒光猝滅效應(yīng)，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，兩者之間形成了復(fù)合物。通過計(jì)算不同溫度時(shí)CCDs與hFIB作用的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，可以推斷兩者通過靜電作用力結(jié)合。圓二色光譜和同步熒光光譜結(jié)果表明，CCDs的加入改變了hFIB的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量先增大后減小，說(shuō)明CCDs濃度大于1.0 μmol/L時(shí)會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生變性作用，具有一定的血液毒性。本文中的研究結(jié)果對(duì)CCDs在生物成像及載藥性能方面的應(yīng)用具有參考價(jià)值。