楊 鈺 ，楊靖宜，陳志彬，陳燦昆，范志祥，張延潔，張 璐，萬(wàn)瑞雪，龍 莉

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明 650031；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，云南昆明 650500；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳科，云南昆明 650101）

CX3CR1為G-蛋白偶聯(lián)受體，須與Fractalkine（Fkn） 相結(jié)合方可發(fā)揮生物學(xué)作用，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。CX3CR1 基因共含1065 個(gè)核苷酸，可編碼355 個(gè)氨基酸，位于3p21 -3pter[1]。McDemott 等[2]發(fā)現(xiàn)其跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)共有5 個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNP），而V249I 多態(tài)位點(diǎn)就是其中之一。V249I 多態(tài)性是指位于CX3CR1 基因第二外顯子上的745 位點(diǎn)堿基發(fā)生G→A 突變，使得相應(yīng)的密碼子由纈氨酸（V） 轉(zhuǎn)為異亮氨酸（I）[3]。V249I（G→A） 多態(tài)位點(diǎn)位于CX3CR1 基因編碼區(qū)，故其可影響蛋白質(zhì)翻譯，從而影響受體功能[4]。V249I突變影響炎癥進(jìn)程中白細(xì)胞尤其是吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的游走與活化并介導(dǎo)細(xì)胞間黏附聚集等作用，甚至可能影響疾病遺傳易感性[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)V249I 多態(tài)與多種炎癥性疾病和某些傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6]，但其機(jī)制目前為止尚未完全明確。本文著力于研究、描述云南省晉寧縣彝族健康人群CX3CR1 基因V249I 位點(diǎn)多態(tài)分布情況及其與國(guó)內(nèi)外不同種族及不同民族之間的差異，為探索CX3CR1 基因相關(guān)疾病分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

昆明市晉寧縣雙河彝族鄉(xiāng)彝族健康村民共245人，其中男性82 例，女性163 例，平均年齡（60.2±12.1） 歲；經(jīng)病史調(diào)查、體檢報(bào)告、實(shí)驗(yàn)室檢查等資料將高血壓、冠心病、心肌病、先天性心臟病和瓣膜性心臟病患者排除在外。本研究已通過(guò)倫理道德審查且所有對(duì)象對(duì)調(diào)查、取樣項(xiàng)目知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取抽取靜脈血2 mL 后采用EDTA 抗凝，使白細(xì)胞分離，低滲溶血，酚-氯仿有機(jī)抽提法提取基因組DNA，TE 緩沖液溶解，4℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 目的片段的PCR 擴(kuò)增采用PCR 技術(shù)特異性擴(kuò)增CX3CR1 基因的一段包含V249I 位點(diǎn)的DNA 引物序列。上游引物為：5'-CCGAGGTCCTCCAGGAAATCT-3'；下游引物為5'-TCAGCATC AGGTTCAGGAACTC-3'；30 μL PCR反應(yīng)體系包含：正反引物各1.3 μL，TaqDNA 聚合酶15 μL（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司），雙蒸水（ddH2O） 11.4 μL，DNA 樣本1 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，循環(huán)35 次；于72 ℃延伸10 min。

1.2.3 基因型鑒別采用RFLP 法檢測(cè)基因型。酶切體系共18 μL：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，0.5 μL 限制性內(nèi)切酶Acl I（Bio Basic 公司），雙蒸水（ddH2O）8.8 μL，10×Buffer2.7 μL，37℃孵育過(guò)夜（24～36 h）。反應(yīng)終止后將消化片段于2.5%瓊脂糖凝膠上電泳（添加Goldview-I 型核酸染色劑），凝膠成像系統(tǒng)判斷酶切結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 軟件。χ2檢驗(yàn)分析基因型及等位基因頻率，且檢驗(yàn)Hardy-Weinberg 平衡定律，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)

分析結(jié)果為χ2=3.286，P=0.279，說(shuō)明CX3CR1 基因 V249I 位點(diǎn)多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，即所選用的人群樣本具有群體代表性，結(jié)果具有說(shuō)服力。

2.2 基因型鑒定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為588 bp。該片段用限制性內(nèi)切酶Acl I 進(jìn)行酶切時(shí)，若CX3CR1 基因745 位點(diǎn)沒(méi)發(fā)生突變，編碼的氨基酸為G，則擴(kuò)增產(chǎn)物被Acl I 切開(kāi)會(huì)產(chǎn)生205 bp、383 bp 二個(gè)片段；若745 位點(diǎn)的G 被A 替代，編碼的氨基酸變?yōu)镮，原有的Acl I 酶切位點(diǎn)消失，Acl I 無(wú)法切開(kāi)，即長(zhǎng)度不變。酶切后產(chǎn)生2 個(gè)等位基因V、I，形成3種基因型：II：只產(chǎn)生588 bp 一個(gè)片段（無(wú)突變純合子） VV：產(chǎn)生205 bp、383 bp 二個(gè)片段（突變雜合子）；VI：產(chǎn)生588 bp、383 bp 和205 bp 三個(gè)片段（突變雜合子），見(jiàn)圖1。

圖1 CX3CR1 基因V249I 多態(tài)性3 種基因型凝膠電泳圖Fig.1 Three genotype of CX3CR1 gene V249I polymorphism were showed by agarose electrophoresis image

2.3 V249I 多態(tài)性在云南彝族人群中的分布

昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)245 例彝族健康人群中，CX3CR1 基因249I 位點(diǎn)有VV、VI、II 三種基因型，其基因型頻率分別為86.53%、12.25%、1.22%；V、I 等位基因頻率分別為92.65%和7.35%。在男性中，基因型頻率為VV（91.46%）、VI（7.32%）、II（1.22%）；V、I 等位基因頻率分別為95.12%、4.88%。在女性中，基因型頻率為VV（84.05%）、VI（14.72%）、II（1.23%）；V、I等位基因頻率則分別為91.41%、8.59%。經(jīng)過(guò)比較，在不同性別中該位點(diǎn)的多態(tài)性分布無(wú)顯著差異（基因型為χ2=2.791，P=0.248；等位基因?yàn)棣?=2.207，P=0.137），見(jiàn)表1。

2.4 CX3CR1 基因V249I 多態(tài)性分布與其它文獻(xiàn)報(bào)道的比較

現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不同種族或民族人群CX3CR1 基因位點(diǎn)多態(tài)性分布的研究結(jié)果與本研究進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：云南彝族健康人群中V249I多態(tài)性位點(diǎn)以VV 型為主，日本人、傣族人、景頗族人、漢族人、新疆漢族人、湖南漢族人、包頭漢族人群缺少II 基因型。云南彝族與報(bào)道的日本人[7]、法國(guó)人[8]、意大利人[9]、高加索人[10]、希臘人[11]、印度[12]人、塞爾維亞人[13]、維吾爾族人[14]、新疆漢族人[14]、漢族人[15]比較，其CX3CR1 基因型分布與基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與景頗族人[16]、傣族人[16]、湖南漢族人[17]、包頭漢族人[18]相比無(wú)論從基因型分布或是基因頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

云南彝族人群VV 基因型頻率為86.53%，顯著高于已報(bào)道的維吾爾族人（72.45%）、塞爾維亞人（62.60%）、意大利人（52.94%）、希臘人（52.12%）、高加索人（50.60%）、法國(guó)人（50.32%）、印度人（50.00%），P＜0.05；但顯著低于新疆漢族人（95.74%）、漢族人（95.24%）、日本人（91.83%），P＜0.05；云南彝族人群VI 基因型頻率為12.25%，高于漢族人（4.76%）、新疆漢族人（4.26%），P＜0.05；同時(shí)低于法國(guó)人（43.34%）、高加索人（41.77%）、意大利人（41.18%）、印度人（39.33%）、希臘人（35.76%）、塞爾維亞人（32.47%） 和維吾爾族人（23.47%）（P＜0.05）；云南彝族人群II 基因型頻率為1.22%，顯著低于希臘人（12.12%）、印度人（10.67%）、高加索人（7.63%）、法國(guó)人（6.34%）、意大利（5.88%）、塞爾維亞人（4.30%），P＜0.05。

云南彝族人群V 等位基因頻率為92.65%，顯著高于維吾爾族人（84.18%）、塞爾維亞人（78.83%）、意大利人（73.53%）、法國(guó)人（71.96%）、高加索人（71.49%）、希臘人（70.0%）和印度人（69.69%），P＜0.01；低于新疆漢族人（97.87%） 和漢族人 （97.60%）、日本人（95.92%），P＜0.01。云南彝族人群I 等位基因頻率為7.35%，低于印度人（30.31%）、希臘人（30.00%）、塞爾維亞人（21.17%）、高加索人（28.51%）、法國(guó)人（28.04%）、意大利人（26.47%） 和維吾爾族人（15.82%），P＜0.01，但高于日本人（4.08%）、漢族人（2.40%） 和新疆漢族人（2.13%），P＜0.01，與其他民族比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 彝族CXC3R1 基因V/I 多態(tài)性的分布［n（%）］Tab.1 Distribution of CX3CR1 gene V249I polymorphism in Yi nationality population ［n（%）］

表2 不同人群CXC3R1 基因V249I 多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率［n（%）］Tab.2 Genotype frequency and gene frequency of CX3CR1 gene V249I polymorphism comparison between Yi nationality and other populations ［n（%）］

3 討論

Fkn 是CX3C 趨化因子家族中獨(dú)特的促炎因子，以可溶性和膜結(jié)合形式存在，主要由大腦、心臟及外周血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。其特異性受體CX3CR1 存在于單核細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞膜上，兩者之間相互作用可導(dǎo)致炎癥發(fā)生[19]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CX3CR1 基因V249I 多態(tài)性與某些傳染性疾病以及多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。朱阿楠[20]等發(fā)現(xiàn)V249I 突變對(duì)Fkn 趨化活性、結(jié)合率均下降，并減緩糖尿病腎?。―N） 進(jìn)程。例如Combadiere 等[21]發(fā)現(xiàn)CX3CR1 基因V249I 多態(tài)性與年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD） 相關(guān)。Moatti 等[22]發(fā)現(xiàn)CX3CRl 上只有I 等位基因可用于預(yù)測(cè)評(píng)估急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，說(shuō)明Fkn 分子與血管性疾病有相關(guān)性；正如李文龍等[23]的研究顯示：冠狀動(dòng)脈硬化性疾?。–AD） 患者的V249I 頻率較低，即推測(cè)V249I 多態(tài)是CAD 的保護(hù)性因素。近年有研究發(fā)現(xiàn)V249I 多態(tài)可能為缺血性腦血管病（ICVD） 的遺傳易感因素[24]，且體外試驗(yàn)證實(shí)V249I 多態(tài)性還在腎小球腎炎發(fā)病中起作用[25]。但CX3CR1 基因V249I 多態(tài)與疾病的關(guān)系，在不同的民族或種族中，可能會(huì)得出不同的結(jié)論。如劉明旭等[14]檢測(cè)到V249I 多態(tài)性可能與新疆維吾爾人群中HIV-1 易感性有關(guān)；而鄧小玲等[26]卻推測(cè)四川彝族人群HIV-1 感染者與正常人中V249I 多態(tài)分布無(wú)顯著差異。這可能是由于不同民族遺傳背景不同導(dǎo)致對(duì)疾病易感性存在差異。除了上述慢性病外，最近的研究提示V249I 多態(tài)性還與腫瘤的發(fā)生過(guò)程相關(guān)[27]；瘤內(nèi)CX3CL1-CX3CR1 信號(hào)被證明直接影響膠質(zhì)瘤的侵襲和粘連行為，V249I 多態(tài)性提高膠質(zhì)瘤患者術(shù)后的總存活率，減少TAM 浸潤(rùn)。

云南彝族與其他民族和種族具有不同的遺傳背景，如龍莉等[28-33]發(fā)現(xiàn)M235T、T280M 等多種基因的多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在云南彝族與其他民族或種族中的分布均有顯著差異。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于云南彝族CX3CR1 基因V249I 位點(diǎn)多態(tài)性的研究較少，對(duì)云南彝族進(jìn)行基因?qū)用娴难芯靠蔀槟壳疤岢珳?zhǔn)醫(yī)療，個(gè)體化醫(yī)療方案提供一定證據(jù)。本研究對(duì)部分已報(bào)道種族、民族CX3CR1 基因V249I 多態(tài)性分布進(jìn)行收集、描述統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：云南彝族與報(bào)道的日本人、法國(guó)人、意大利人、高加索人、希臘人、印度人、塞爾維亞人、維吾爾族、漢族、新疆漢族比較，V249I 基因型分布與基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明在不同地域、不同種族的健康人群中，V249I 基因型及其等位基因頻率分布存在差異，其中以不同種族之間的差異更為顯著。

以上國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展與結(jié)果都提示趨化因子受體CX3CR1 在炎性疾病、AMD 與AIDS 等疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，而V249I 多態(tài)性很大程度上影響著CX3CR1 的表達(dá)。各種族與民族遺傳背景的不同使得其疾病發(fā)生與發(fā)展可能存在差異，通過(guò)研究人類基因多態(tài)性，可掌握基因在不同人群中的分布狀況，從基因水平對(duì)疾病在不同民族、種族中表現(xiàn)的易感性、發(fā)病率差異的潛在機(jī)制進(jìn)行初步探索。此外，開(kāi)展多地區(qū)、大樣本的研究并對(duì)CX3CR1 的其他多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行篩查，有助于明確CX3CR1 基因多態(tài)性在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為疾病排查、治療提供新的靶點(diǎn)。