劉 韜 ，吳希軍，朱萬蕓，陳建雯，陽 敬，沈志強，劉 光，柴文英，陳 鵬

（1） 紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，云南紅河 661100；2） 五蓮縣康復(fù)醫(yī)院，山東日照 262300；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500；4） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，云南昆明 650032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 作為一種慢性炎性疾病，是大多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，不穩(wěn)定的粥樣斑塊一旦破裂或者斑塊募集血小板等血細胞而形成血栓，則有可能導(dǎo)致缺血性心腦血管事件，也是最常見的死亡原因之一[1]。其復(fù)雜多階段性病理過程給臨床治療帶來了困難。有研究指出，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與動脈粥樣硬化形成過程密切相關(guān)，其中TLR4 在人體冠狀動脈斑塊中表達較為明顯[2]。TLR4 能夠識別細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 介導(dǎo)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與免疫應(yīng)答的啟動過程，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展[3]。有研究表明，動脈內(nèi)皮細胞表達的TLR4 主要與動脈粥樣硬化有關(guān)，而靜脈內(nèi)皮細胞表達的TLR4 更可能與感染性心肌病和充血性心力衰竭有關(guān)[4]。因此，TLR4 對AS 的發(fā)生起到了重要的作用。目前，AS 常用的化學(xué)治療藥物有他汀類、抗血板和抗血脂藥等，但預(yù)后不太理想，存在一定的不良反應(yīng)。因此，迫切需要尋找和開發(fā)療效確切、不良反應(yīng)較小的天然藥物。

Corilagin （結(jié)構(gòu)式見圖1） 作為一種多酚類化合物，可以從滇產(chǎn)特色植物藥苦味葉下珠中提取分離，不良反應(yīng)小，臨床應(yīng)用日趨廣泛[5]。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，Corilagin 可通過有效抑制中性粒細胞與血小板之間的相互作用、降低C 反應(yīng)蛋白（CRP） 和氧化低密度脂蛋白受體-1（LDL-1） 的表達、降低細胞內(nèi)鈣離子濃度、影響細胞周期和增殖、保護血管內(nèi)皮細胞和抑制血管平滑肌細胞增殖遷移等機理發(fā)揮抗AS 作用[5-8]。本研究擬復(fù)制家兔動脈粥樣硬化模型和用ox-LDL 損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），探討Corilagin 對TLR4 蛋白及mRNA 表達的影響，為進一步研究抗AS 新型藥物提供理論和實驗依據(jù)。

圖1 Corilagin 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of corilagin

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

Corilagin 由中科院昆明植物研究所提供，分子式為C27H22O18，純度99%，分子量634.5，無臭、黃褐色粉末。辛伐他汀，上海信宜萬象藥業(yè)有限公司提供，純度＞99%，分子量418.6。維生素E 原粉購于Sigma 公司，避光干燥保存。

高脂飼料：84.5%基礎(chǔ)飼料中加入10%豬油，4%蛋黃粉，1.5%膽固醇，本實驗室配制。Ox-LDL，廣州奕源生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基屬美國Gibco 公司產(chǎn)品。Golden Taq PCR 試劑盒，TRNzol-A+總RNA 提取試劑裂解液和BCA 蛋白檢測試劑盒均屬天根生化科技（北京） 有限公司產(chǎn)品；TLR4 和β-actin 一抗及二抗羊抗兔均從美國Abmart 公司購得；Purelink TM基因組DNA 小量提取試劑盒，Superscript III cDNA合成試劑盒，引物，Platinum SYBR Green qPCR 試劑盒，購自美國Invitrogen 公司；膠片購自柯達公司，蛋白印跡實驗的發(fā)光底物屬Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物和細胞

清潔級新西蘭白兔，雌雄各半，體重1.8～2.2 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，合格證號：SCXK（滇） 2005-0008。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC） 系購自中國典型物保藏中心（Cell Line Designation:HUV-EC-C ATCC Catalog No.CRL-1730），本次實驗選擇生長良好的4-8 代細胞用于實驗。

1.3 主要儀器

蛋白定量儀（德國Thermo 公司）、垂直電泳儀和Mini Protein-3 型膜轉(zhuǎn)印裝置（美國Bio-rad 公司），WD-9405 型水平脫色搖床，WH-986 型靜音混合儀（北京六一儀器廠），Leica RM2135 切片機（德國Leica 公司），全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）；核酸定量儀（德國Thermo 公司），TPC-0220G 型PCR 擴增儀，7500 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及高脂喂養(yǎng)致家兔AS 模型將家兔隨機分為正常對照組、模型對照組、2.5 mg/kg辛伐他丁陽性對照組、1 mg/kg、2 mg/kg 和4 mg/kg Corilagin 組，10 只/組。

動物均分籠單只飼養(yǎng)，實驗前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。正常對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理；其余各實驗組飼喂高脂飼料，自由飲水。12 周后，每組各抽取2 只動物處死，取主動脈血管進行病理學(xué)檢查。顯微鏡下可見增厚的血管內(nèi)膜，血管內(nèi)皮細胞排列不整齊、不連續(xù)，血管平滑肌細胞大量遷移至血管內(nèi)膜并見泡沫細胞，病理學(xué)結(jié)果提示家兔AS 模型復(fù)制成功。

1.4.2 細胞分組及ox-LDL 誘導(dǎo)損傷的HUVEC細胞模型復(fù)制選生長狀態(tài)良好的HUVEC 制備細胞懸液，通過計數(shù)調(diào)整上述細胞濃度到1×106mL/L，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察HUVEC 生長情況。用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，同化HUVECs 24 h 后作為備用細胞。將上述細胞分成9 組，即正常對照組；模型組；10 μmol/L Vit E 組、1 μmol/L 辛伐他汀組；3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的Corilagin 藥物組（終濃度）。同化后棄培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基，并分別加入相應(yīng)濃度的陽性藥及Corilagin，孵育24 h，除正常對照組外其余組HUVECs 細胞中加入終濃度為70 mg/L 的ox-LDL 10 μL 刺激12 h，復(fù)制損傷模型。每組設(shè)6 個平行孔，實驗重復(fù)3 次。

1.4.3 Q-PCR 方法測定家兔動脈粥樣硬化斑塊和ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 的mRNA 表達利用蛋白酶消化液收集HUVEC 細胞；研缽中裝有液氮，將各組主動脈斑塊組織研磨成粉末。總RNA 提取使用Trizol 一步法。純度檢測和定量后取1 μg RNA，cDNA 的獲得可采用Superscript III cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄進行，以2 μL 的cDNA 為模板，SYBR Green II 染料法進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系：上下游引物（0.2 μmol/L） 各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，含2×AllinOneTM Q-PCR Mix 10 μL。Ct 值采用Rotor-Gene 6.1.0.81軟件進行分析檢測。5'-3'PCR 引物：TLR4 目的基因，上游CCATTTTATGTCATTTTCTT，下游GCTATCTGTGAGCGTGTATC；β-actin 內(nèi)參，上游引物TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下 游 引 物GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC。各樣本的內(nèi)參基因和TLR4 目的基因均設(shè)3 個復(fù)孔，并計算Ct平均值。本研究基因的表達變化采用△△Ct 相對定量法進行。使用相對定量法表示目的基因TLR4的拷貝數(shù)，內(nèi)參基因先進行標化，先后獲得對照組、實驗組的目的基因、內(nèi)參基因的CT 值，△CT（1） ＝（實驗組目的基因CT 值－實驗組內(nèi)參基因CT 值）；△CT（2） ＝（對照組目的基因CT 值－對照組參考基因CT 值）；△△CT＝△CT（1）－△CT（2）。實驗組目的基因相對于內(nèi)參基因的表達相對定量用2-△△CT表示，得到TLR4 基因的相對表達量。

1.4.4 Western Blot 方法測定家兔動脈粥樣硬化斑塊和ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 的蛋白表達 將各組血管斑塊組織剪碎后放入裝有液氮的冷研缽中，充分研磨，然后加入300 mL 單去污劑裂解液（含PMSF） 于冰浴中裂解提取HUVEC 總蛋白質(zhì)。標準曲線以牛血清白蛋白制作，蛋白濃度采用BCA 法檢測。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后分別加入TLR4 一抗和β-actin 內(nèi)參，于洗膜后再用二抗羊抗兔進行孵育。試劑激發(fā)熒光用Western blot 檢測，顯示于X 光片，顯影、掃描，系統(tǒng)成像經(jīng)數(shù)碼凝膠圖像定量分析、條帶的灰度值經(jīng)條帶密度掃描檢測。內(nèi)參為同管β-actin，計算目的蛋白TLR4 的相對表達量（TLR4 目的基因/ 內(nèi)參β-actin）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Corilagin 對家兔動脈粥樣硬化斑塊中TLR4蛋白及mRNA 表達的影響

2.1.1 Corilagin 對家兔動脈粥樣硬化斑塊中TLR4 mRNA 表達的影響從圖2 顯示，18 S 與28 S 兩個條帶清晰可見，28 S 亮度大約是18 S 的兩倍，膠上無其它大分子條帶；說明總RNA 提取完整，無大分子物質(zhì)的污染，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR 實驗。

Q-PCR 結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)造模后，模型對照組胸主動脈斑塊TLR4 mRNA 表達水平明顯升高，與正常對照組比較P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 劑量的Corilagin 與2.5 mg/kg 辛伐他汀均明顯降低胸主動脈斑塊TLR4 mRNA 的表達水平，與模型組比較，P＜0.05，見表1。

圖2 總RNA 提取完整性檢驗Fig.2 The extraction integrity test of total RNA

表1 Corilagin 對家兔AS 斑塊中TLR4 mRNA 表達的影響（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表1 Corilagin 對家兔AS 斑塊中TLR4 mRNA 表達的影響（）Tab.1 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，▲P＜0.05。

2.1.2 Corilagin 對家兔動脈粥樣硬化斑塊中TLR4蛋白表達的影響高脂飼料喂養(yǎng)造模后，模型對照組斑塊TLR4 蛋白表達水平明顯升高，與正常對照組比較，P＜0.05。1、2 和4 mg/kg 劑量的Corilagin 與2.5 mg/kg 辛伐他汀均能明顯降低斑塊TLR4 蛋白的表達水平，與模型組比較，P＜0.05，見圖3，表2。

圖3 AS 斑塊中TLR4 蛋白表達水平Fig.3 The expression level of TLR4 protein 1:正常對照組；2:2.5 mg/kg 辛伐他汀組；3～5:4、2 和1 mg/kg 的Corilagin 組；6:模型對照組。

表2 Corilagin 對家兔AS 斑塊中TLR4 蛋白表達的影響（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

表2 Corilagin 對家兔AS 斑塊中TLR4 蛋白表達的影響（）Tab.2 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in rabbit AS plaque （）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，▲P＜0.05。

2.2 Corilagin 對ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4蛋白及mRNA 表達的影響

2.2.1 Corilagin 對ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA 表達的影響Q-PCR 結(jié)果顯示，用ox-LDL 培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC 24 h 后，與正常對照組比較，ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA 表達上調(diào)，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與ox-LDL 損傷模型組比較，用不同濃度Corilagin（3.125-25 μmol/L） 干預(yù)HUVEC 24 h 后，隨著Corilagin 濃度的升高其TLR4 的mRNA 表達量減少，與ox-LDL 損傷模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 Corilagin 對ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA表達的影響（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

表3 Corilagin 對ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 mRNA表達的影響（）Tab.3 Effect of Corilagin on the mRNA expression of TLR4 in ox-LDL injured HUVEC （）

與正常對照組比較，##P＜0.01；與ox-LDL 模型組比較，**P＜0.01。

2.2.2 Corilagin 對ox-LDL損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白的影響 實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，ox-LDL 模型組的蛋白表達明顯提高（P＜0.05）；與ox-LDL 模型組比較，Corilagin 各組及陽性對照藥1 μmol/L 辛伐他汀、10 μmol/L 維生素E能夠明顯抑制TLR4 蛋白表達（P＜0.05），且Corilagin 各組成量效關(guān)系抑制TLR4 蛋白表達（見圖4和表4）。

圖4 ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白表達水平Fig.4 The expression level of TLR4 protein in HUVEC injured by ox-LDL

表4 Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVEC 中TLR4 蛋白表達的影響（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

表4 Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVEC 中TLR4 蛋白表達的影響（灰度值） （）Tab.4 Effect of Corilagin on the protein expression of TLR4 in HUVEC injured by ox-LDL（）

與正常對照組比較，#P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3 討論

心血管疾病是全世界最常見的死亡原因，到2030 年，死亡人數(shù)預(yù)計將達到3 000 萬。AS 是心血管疾病的主要病因之一，全球每年約有2 000 萬人死于AS[9]。目前，隨著調(diào)血脂、抗血小板和他汀類等藥物的使用，AS 病死率有所下降，但存在一定的不良反應(yīng)，預(yù)后不理想。因此，尋找和開發(fā)新的療效明確、不良反應(yīng)較小的天然藥物具有重要意義。有研究表明，Corilagin 具有廣泛的臨床應(yīng)用價值，例如，具有抗腫瘤、肝保護、抗炎等作用[10]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了Corilagin 可影響HUVEC 和VSMC 的增殖和下調(diào)LOX-1 蛋白及mRNA 的表達，起到良好的抗AS 作用。然而Corilagin 對TLR4 基因的調(diào)控作用尚未有研究報道。因此，在本研究中，筆者探索了Corilagin 對AS 斑塊及ox-LDL 受損的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA 表達影響，進一步探索Corilagin 對AS 的作用機制，為深入研究抗AS 新型藥物提供科學(xué)的理論和實驗依據(jù)。

TLR4 是一種炎癥因子，處于全身炎癥瀑布效應(yīng)的中間環(huán)節(jié)，主要通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 依賴型與非MyD88 依賴型通路參與炎性反應(yīng)。在MyD88 依賴通路中，TLR4 主要通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶MAPKs 導(dǎo)致炎性因子的產(chǎn)生和釋放[11]。該聯(lián)級反應(yīng)中涉及到很多關(guān)鍵因子，例如，絲/ 蘇氨酸白細胞介素-1 受體激酶I-RAKs、腫瘤壞死因子受體活化因子 6（TRAF-6）。在非MyD88 依賴型通路中，TLR4 可通過激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3） 和NF-κB 來釋放INF-1 和各種炎癥因子的產(chǎn)生和釋放[12]。有研究表明，在膿毒血癥小鼠模型上，Corilagin 可下調(diào)TLR4 表達抑制MyD88 依賴通路，從而減少炎癥反應(yīng)[2]。Yonekawa 等[13]提出TLR4 在破裂斑塊中的含量遠高于外周血。有研究團隊也在AS 病變動脈平滑肌細胞上也檢測到TLR4 高表達[14]。除此之外，Katsargyris 和Michelsen 等[12]研究人員發(fā)現(xiàn)未使用他汀類藥物的患者TLR4 的表達水平明顯高于使用者，TLR4 基因缺陷的小鼠粥樣斑塊的形成比正常小鼠要小得多。同樣的，在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的模型對照組中TLR4 蛋白及mRNA的表達顯著高于正常對照組。ox-LDL 是影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，具有細胞毒性作用，可通過氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1） 上調(diào)血管轉(zhuǎn)錄基因，激活核轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的表達，從而損傷血管內(nèi)皮細胞、促進平滑肌細胞增生，使局部內(nèi)膜出現(xiàn)粥樣斑塊[15]。本實驗表明，Corilagin 能明顯抑制ox-LDL 損傷的HUVEC 中TLR4 蛋白和mRNA的表達（表3-6；圖3-6）。因此，Corilagin 對抗動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與下調(diào)TLR4 表達量密切相關(guān)，但具體通過哪條通路影響TLR4 的表達尚需進一步探索。