凌江紅,周芬敏,陳珺明,郭錦榮,上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院中醫(yī)科 上海市 200021

凌江紅,上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院消化科 上海市 200021

文一惠,廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科 廣西壯族自治區(qū)南寧市530021

0 引言

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是一個真核生物維持細胞生存的重要的呈網(wǎng)狀結構的細胞器.在某些生理及病理情況下,ER功能紊亂,細胞為維持自身穩(wěn)態(tài),發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[1],進而激活自噬[2].ERS-自噬是一種重要的細胞自我保護機制,維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),能夠促進細胞的生存,增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性[3-5].研究表明[6],肝癌細胞內(nèi)存在ERS的活化.金剛藤具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效.金剛藤對多種實體腫瘤具有一定療效[7,8],課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金剛藤具有良好的抗肝癌作用[9].本研究運用ERS誘導劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)誘導人肝癌SMMC-772細胞ERS-自噬,并觀察金剛藤對DTT誘導的ERS-自噬SMMC-7721細胞增殖的影響,旨在深入探討金剛藤抗肝癌的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司,許可證編號為SCXK(滬)2018-0004,雌雄不限,鼠齡8-10 wk,共8只.大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后用于實驗,喂養(yǎng)期間大鼠自由進食、水.人肝癌SMMC-7721細胞株由上海中科院細胞庫提供.將SMMC-7721細胞按1×106個/板接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2、恒溫恒濕條件的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1-2 d換液傳代1次.待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗.中藥金剛藤購自廣西民族醫(yī)藥研究所,產(chǎn)地廣西,批號為161201,由桂林鼎康中藥飲片有限公司生產(chǎn).DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗混合液、胎牛血清購自美國GIBCO公司.DTT購自中國Solarbio公司.Apoptosis Detection Kit購自上海翊圣生物科技有限公司.細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)抗體購自英國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):復蘇存活下來的SMMC-7721細胞培養(yǎng)于10 cm細胞培養(yǎng)皿中,細胞接種106個/板.培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗,37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1-2 d換液傳代備用.

1.2.2 ERS-自噬模型的建立:實驗分組及處理方法:取生長狀態(tài)良好的SMMC-7721細胞按DTT不同濃度分為50、200、500 μmol/L組,同時設DTT 0 μmol/L為control組,將細胞按80%的匯合度接種到6孔板,每孔2 mL,細胞數(shù)量為2 × 105個/孔,培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%PS,每組3個復孔.置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,次日分別更換不同濃度(0、50、200、500 μmol/L)培養(yǎng)基稀釋的DTT,置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

Western blot法檢測各組細胞LC3-Ⅱ蛋白表達:將上述細胞去除培養(yǎng)基,PBS清洗兩遍,去除PBS后,加入100 μl含PMSF的裂解液,4 ℃裂解30 min.裂解完后,12000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清,用BCA法測定蛋白濃度.以20 μg總蛋白上樣,行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉封閉1 h.置于1×TBST緩沖液中,于搖床上緩慢洗滌3次,5 min/次.然后移入一抗β-actin (1:5000)、LC3-Ⅱ(1:1000),置于4 ℃孵育過夜.次日洗膜后加入二抗(羊抗兔1:50000)中,室溫搖床孵育2 h.PBST洗3次,每次5 min,顯色.用Image軟件對每個條帶灰度值進行分析.

1.2.3 透射電鏡觀察自噬小體:將細胞離心棄上清,加入電鏡固定液固定,50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水,丙酮置換,浸漬、包埋、切片,用醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗,用透射電鏡檢測.

1.2.4 金剛藤對ERS-自噬肝癌細胞模型增殖能力的影響:金剛藤水煎液及含藥血清的制備:(1)金剛藤水煎液的制備:200 g金剛藤飲片,加水至高出藥物表面2 cm處,浸泡2 h武火煮沸后改用文火煎煮30 min,冷卻,過濾取汁(濾液1),濾渣如上法再煎2次,得到濾液2,濾液3,混合3次得到的藥液,濃縮至100 mL,得到2 g/mL的藥液,4 ℃保存?zhèn)溆? (2)含藥血清的制備:SPF級SD大鼠8只,隨機分為空白組(control組)、金剛藤組(JGT組)、每組4只;JGT組以2 g/mL的金剛藤水煎液灌胃4 mL,control組給予等體積生理鹽水灌胃,每天灌胃2次、間隔12 h,連續(xù)給藥3 d; 末次給藥1 h后以CO2窒息法處死小鼠,心臟取血,靜置后離心15 min取血清,合并同組血清,過濾、滅活除菌后得到含藥血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆?

實驗分組及給藥方法:取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞分為control組、JGT-L組、DTT+JGT組,用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL,加入96孔培養(yǎng)板、每孔0.1 mL,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜,待細胞貼壁70%-80%時,棄去細胞培養(yǎng)液.Control、JGT組分別加入空白含藥血清和金剛藤含藥血清分別培養(yǎng)12 h.DTT+JGT組則予DTT 500 μmol/L孵育24 h后更換金剛藤含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)12 h.

CCK-8法檢測各組細胞的存活率:每組重復6個副孔,每孔分別加入10 μL的CCK-8,繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h.用酶標儀測定450 nm波長處各孔的光密度值(OD值),計算細胞的存活率,存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%.

統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件.計量資料以mean ± SD表示,多組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 SMMC-7721細胞ERS模型的建立

2.1.1 各組SMMC-7721細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達:與contorl組比較,各濃度處理組細胞中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達均顯著升高(P均＜0.05).與200 μmol/L組比較,500 μmol/L組LC3-Ⅱ蛋白的表達顯著升高(P＜0.05,表1,圖1).

2.1.2 各組細胞自噬小體的檢測:DTT干預各組細胞內(nèi)均可見自噬小體(如箭頭所示),并且隨著DTT濃度的增加,自噬小體數(shù)量逐漸增加,DTT 500 μmol/L組可見大量自噬小體(圖2).

2.2 金剛藤對ERS肝癌細胞模型存活率的影響JGT、DTT+JGT組細胞存活率均顯著低于control組(P＜0.05); JGT組細胞存活率顯著低于DTT+JGT組(P＜0.05,表2).

3 討論

ER是存在于真核生物細胞內(nèi)的網(wǎng)狀結構,具有調(diào)控細胞生理功能和維持細胞生存的作用,是細胞對蛋白質(zhì)合成后進行正確折疊和翻譯后修飾的重要細胞器,維持著細胞生存及功能,在某些情況下,如鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應激、感染等導致ER功能紊亂,致未折疊或錯誤折疊的蛋白堆積,則引發(fā)ERS[10].研究表明,在多種實體腫瘤中,腫瘤細胞快速增殖,使得腫瘤細胞在生長的過程中,普遍存在缺血、缺氧的情況[11]; 此外,腫瘤細胞的快速增殖,需要合成大量蛋白質(zhì),這便可能有部分蛋白質(zhì)折疊錯誤或者未折疊產(chǎn)生并堆積[12].有研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者肝癌細胞ERS是被激活的[6].DTT是一種ERS誘導劑,可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的氧化,干擾蛋白二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)在蛋白質(zhì)二硫鍵形成中的催化作用,導致錯誤折疊的蛋白大量堆集,從而誘發(fā)ERS[13].Cheng等[14]成功利用DTT復制癌細胞ERS模型.嚴冬梅等[15]等運用DTT誘導SMMC-7721細胞ERS,并觀察了SMMC-7721細胞ERS狀態(tài)下組蛋白的表達.

圖 1 各組SMMC-7721細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ的表達.LC3-Ⅱ:微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

自噬系統(tǒng)是真核生物細胞蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)之一[16].ERS可誘導自噬的發(fā)生[2,17].本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度DTT(50、200、500 μmol/L)處理SMMC-7721細胞24 h后,細胞中的自噬小體增多,以DTT 500 μmol/L組更為明顯.微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),參與了自噬體的形成.自噬時,微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ,LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ,LC3-Ⅱ附著在自噬體膜上,是自噬體結構蛋白,蛋白活性與細胞自噬水平呈正相關,是自噬發(fā)生的標志[18].本研究運用不同濃度DTT 處理SMMC-7721細胞24 h,觀察到DTT可顯著上調(diào)SMMC-7721細胞中自LC3-Ⅱ蛋白的表達,隨著DTT濃度的增加,LC3-Ⅱ蛋白的表達增加,DTT 500 μmol/L組LC3-Ⅱ蛋白的表達最高,與Control組比較,差異具有統(tǒng)計學意義.由此可見,DTT可誘導SMMC-7721細胞ERS-自噬的發(fā)生.

無限增殖是惡性腫瘤細胞的重要特征之一,許多抗癌藥物都是通過抑制腫瘤細胞增殖來發(fā)揮抗腫瘤作用.課題組前期用MMT法檢測10種壯藥含藥血清對SMMC-7721細胞生長的抑制情況,觀察到金剛藤、藤梨根、葉下珠、半枝蓮的含藥血清具有較好的抑制肝癌細胞生長及增殖的作用,其中金剛藤對SMMC-7721細胞抑制作用最強[9],課題組另一項研究表明金剛藤能夠誘導肝癌細胞凋亡,將其阻滯于S期,機制可能與下調(diào)癌基因POLD1的表達有關[19].本研究選用CCK-8法檢測金剛藤對SMMC-7721細胞增殖的影響,觀察到金剛藤可以抑制SMMC-7721細胞增殖,與課題組前期研究結果相一致.有研究表明[5],ERS-自噬對細胞的保護作用是腫瘤細胞化療藥物耐藥的重要原因之一.ERS-自噬可抑制化療藥物順鉑抗人肝癌HepG2細胞的作用[20].本研究結果顯示,DTT+JGT組對SMMC-7721細胞抑制作用較Control組強(P＜0.05),但較JGT組弱(P＜0.05),提示DTT誘導的ERS-自噬,增加了SMMC-7721細胞對金剛藤的抵抗性,使SMMC-7721細胞在金剛藤的干預下細胞存活率的抑制作用減弱.

4 結論

綜上所述,DTT可誘導肝癌SMMC-7721細胞ERS-自噬,金剛藤可抑制SMMC-7721細胞的存活率,DTT誘導的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細胞的存活率.由此推測,抑制ERS-自噬在化療藥物耐藥方面可能具有潛在的應用價值.

表1 各組SMMC-7721細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ的表達(mean ± SD,n=3)

表2 各組SMMC-7721細胞存活率的比較(mean ± SD,n=3)

圖2 各二硫蘇糖醇處理組SMMC-7721細胞的自噬情況.A:Control組; B:DTT 50 μmol/L組; C:DTT 200 μmol/L組; D:DTT 500 μmol/L組.DTT:二硫蘇糖醇.

文章亮點

實驗背景

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤,死亡率位居世界第2位.金剛藤具有抑制肝癌細胞的作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)-自噬的保護作用能夠促進肝癌細胞生存,因而探尋肝癌細胞ERS-自噬對金剛藤抑制肝癌細胞作用的影響具有重要意義.

實驗動機

臨床治療肝癌主要采用手術及化療的方法,但大部分確診患者已失去手術機會,而化療存在副作用大且易產(chǎn)生耐藥性.中醫(yī)藥治療肝癌具有療效穩(wěn)定且副作用小的特點,因而探尋金剛藤抗肝癌細胞的深層機制對于其臨床運用及新的研究方向具有重要指導意義.

實驗目標

探討二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)誘導SMMC-7721細胞ERS-自噬及金剛藤的干預。

實驗方法

ERS-自噬模型的復制:DTT處理SMMC-7721細胞,采用透射電鏡觀察自噬小體和Western blot法檢測微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)蛋白的表達.金剛藤的干預:運用金剛藤干預ERS-自噬肝癌SMMC-7721細胞模型,采用CCK-8法檢測細胞的存活率.

實驗結果

DTT能夠誘導肝癌SMMC-7721細胞ERS-自噬; DTT誘導肝癌SMMC-7721細胞的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細胞的存活率.

實驗結論

DTT可誘導肝癌SMMC-7721細胞ERS-自噬,且DTT誘導肝癌細胞的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細胞的存活率.

展望前景

抑制ERS-自噬在化療藥物耐藥方面可能具有潛在的應用價值.