梁燕妮，劉平江，丘觀玲

(1.2.3.梧州學院，廣西 梧州 543002)

中藥材雞血藤(Millettiadielsiana)是豆科植物密花豆干燥的藤莖，又稱血藤、血風藤、九層風等[1-3]。雞血藤是傳統(tǒng)的中藥材，在歷代的本草著作中均有記載[4]。雞血藤作為桂藥之一，在廣西有著極大的生產量，在廣東、云南、貴州等地也有種植[5]。雞血藤中的主要活性成分為黃酮類物質[6-7]。臨床試驗證明，雞血藤中的黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、降血脂等作用[8]。近年來，學者們對于雞血藤的研究不斷深入，但在提取雞血藤中有效成分方面所取得的成果并不多。利用現(xiàn)代提取技術提取雞血藤有效成分是現(xiàn)今研究的重點。本試驗將通過超聲提取技術對雞血藤總黃酮進行提取，運用響應面法對雞血藤總黃酮提取的工藝進行優(yōu)化，并確定其最佳工藝。

1 材料與儀器

雞血藤、蘆丁標準品、亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉(試劑均為AR級)，752N型分光光度計、中藥粉碎機、電子天平、SB-5200D型超聲清洗機等。

2 試驗方法

2.1 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品10.00 mg，用體積分數(shù)40%的乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻，即獲得質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液。準確量取上述蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于已編號碼的10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min；加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min；加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，最后用30%乙醇定容至刻度，靜置15 min。將波長調至510 nm處，測定各濃度吸光度值。以吸光度A為縱坐標、質量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=9.918 6X-0.005 1，R2=0.999 5。線性關系良好。

2.2 雞血藤總黃酮的提取

準確稱取雞血藤粉末0.25 g，加入50 mL三角瓶中，在一定條件下(料液比、超聲時間、乙醇體積分數(shù))進行超聲提取，然后置于離心機內離心，取上清液測定吸光度[9]。根據(jù)標準曲線回歸方程計算總黃酮含量，并計算總黃酮的提取率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲時間。準確稱取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40加入體積分數(shù)為40%的乙醇。分別超聲提取20，30，40，50，60，70 min，探討超聲時間對總黃酮提取率的影響。

2.3.2 料液比。準確稱取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，加入體積分數(shù)為40%的乙醇溶液，超聲提取40 min。研究料液比對總黃酮提取率的影響。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)。稱取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，超聲提取40 min。探討乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響。

2.4 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定Box-Behnken設計的自變量，以總黃酮提取率為響應值，運用統(tǒng)計軟件Design Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平響應面分析方案，以確定最佳提取工藝參數(shù)。響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 超聲時間對雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖1可見，曲線呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，這表明總黃酮的提取率受到超聲時間的影響，隨超聲時間的變化而變化。當超聲時間為20～40 min時，總黃酮提取率隨著超聲時間的延長而增加；超聲時間為40 min時，曲線達到最高點，此時提取率最高。此后，隨著超聲時間的延長，總黃酮提取率則逐漸緩慢降低。分析原因可能是由于超聲波的作用使藥粉細胞內的黃酮化合物逐漸溶出，在一定超聲時間內，溶出量逐漸增加；但是超聲時間過長，藥粉中的黃酮類物質也會因超聲作用分解，影響了總黃酮的提取率，提取率降低[10-11]。因此最適的超聲時間考察范圍為30～50 min。

圖1 超聲時間對總黃酮提取率的影響

3.1.2 料液比對雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖2可見，當料液比為1∶20～1∶50時，提取率的大小隨著料液比的增大而增加。料液比為1∶50時，提取率達到最大；繼續(xù)增加料液比，總黃酮的提取率則緩慢下降。可能由于在一定量的粉末中，所含黃酮類物質是一定的，料液比的增加也只是增加了溶劑的量，當溶劑達到一定量時，溶入溶劑的黃酮類物質達到了平衡，不會隨著料液比的增加而上升[12-13]；在此之后，繼續(xù)增加料液比會增加雜質的溶出量，使總黃酮提取率反而變小。

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響

3.1.3 乙醇體積分數(shù)對雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖3可見，當乙醇體積分數(shù)為20%～40%時，曲線呈現(xiàn)上升趨勢，說明溶入溶劑中的黃酮類物質逐漸增加，提取率上升；當乙醇體積分數(shù)為40%時提取率達最大值。因溶劑乙醇的極性隨著乙醇體積分數(shù)上升而增大，當乙醇體積分數(shù)為40%時，溶劑的極性與樣品中黃酮類化合物的極性十分相似，黃酮類物質的溶出率最高，總黃酮的提取率也達到最大值；此后，繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，使極性增加，但總黃酮提取率反而降低，其原因可能是雞血藤中所含有的糖類物質、脂溶性物質以及粘稠性的物質會在高體積分數(shù)的乙醇大量析出，從而對粉末中黃酮類物質的溶出造成影響，使總黃酮提取率下降[14]。因此，最適的乙醇體積分數(shù)考察范圍為30%～50%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對總黃酮礙率的影響

3.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

3.2.1 響應面試驗結果。根據(jù)單因素試驗結果，以雞血藤黃酮提取率為響應值，以超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)為自變量，進行響應面優(yōu)化試驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken響應面試驗結果

3.2.2 建立擬合回歸模型方程。通過Design-Expert8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應面二次多項回歸模型方程：

Y=6.23+0.054A+0.056B+0.10C-0.050AB+0.0025AC-0.057BC-0.16A2-0.016B2-0.18C2。

其中，A為超聲時間，B為料液比，C為乙醇體積分數(shù)。

3.2.3 回歸模型方差分析。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，模型P=0.000 1<0.01，表明該模型極顯著。失擬項P=0.123 1>0.05，模型失擬項不顯著，說明本試驗無其他因素影響。模型的決定系數(shù)R2=0.973 3，說明此模型可以解釋97.33%的響應值變化。該模型擬合度較好，試驗誤差小，可以使用此模型進行分析和預測超聲輔助提取雞血藤總黃酮提取率各因素的影響。

表3 回歸模型方差分析

比較各F值可知，A、B、C3個因素對總黃酮提取率的影響由大到小排列如下：C>B>A；一次項中，A、B顯著，C項極顯著，交互項BC對總黃酮提取率的影響顯著，AB、AC項不顯著；模型純誤差的均方為1.02×103。由此可知，各因素對響應值的影響并不是簡單的線性關系。

3.2.4 兩因素交互作用對總黃酮提取率的影響。圖4為超聲時間與料液比的等高線及響應面圖。等高線圖反映出：總黃酮的提取率隨著超聲時間增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，料液比的改變對總黃酮提取率的影響也如此。當超聲時間為40 min，料液比1∶50時，總黃酮的提取率達到最大值；比較料液比與超聲時間變化曲面，料液比坡度較陡，表明出料液比對總黃酮提取率影響較大，此結果與回歸方程的結果一致。在三維空間曲面圖中，料液比軸向等高線稍密集，表明料液比對雞血藤總黃酮提取率的影響較大；超聲時間軸向等高線稍稀疏，說明超聲時間對于提取率的影響較小。

圖4 超聲時間與料液比的等高線及響應面圖

圖5為超聲時間與乙醇體積分數(shù)的等高線及響應面圖。由圖5可見，雞血藤總黃酮提取率隨著乙醇體積分數(shù)及超聲時間的改變而表現(xiàn)出先增后降的趨勢，但乙醇體積分數(shù)對提取率的影響較大；響應面三維圖中，超聲時間這一變化曲面坡度較緩，表明超聲時間對于提取率的影響較小。

圖5 超聲時間與乙醇體積分數(shù)的等高線及響應面圖

圖6為料液比與乙醇體積分數(shù)的等高線及響應面圖，由圖6可見，乙醇體積分數(shù)對雞血藤總黃酮的提取率影響較大。

圖6 料液比與乙醇體積分數(shù)的等高線及響應面圖

3.2.5 最佳工藝條件的預測與驗證。將單因素試驗所得出的結果，用響應面分析軟件進行優(yōu)化試驗設計并進行試驗；將試驗結果輸入軟件中進行響應面分析，確定出超聲輔助提取雞血藤總黃酮的最佳提取條件。最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲提取時間40.95 min、料液比1∶52.18、乙醇體積分數(shù)為40.45%，此條件下總黃酮提取率理論值為6.24%。考慮到實際試驗操作的可行性，在對提取率影響不大的情況下，對提取工藝進行修正，修正后的工藝條件為超聲時間41 min，料液比1∶52，乙醇體積分數(shù)41%。采用修正后的工藝條件進行3次驗證試驗，結果總黃酮提取率為6.19%，相對誤差約為0.8%，說明所建立的數(shù)學模型具有較好的可靠性，響應面法優(yōu)化雞血藤總黃酮提取的工藝條件可行。

4 結論

對雞血藤總黃酮的提取，一直是眾多學者所研究的課題。近年來，作為現(xiàn)代提取技術之一的超聲提取技術被廣泛應用于中藥材有效成分的提取中。為了提高雞血藤藥材中有效成分的提取率，本試驗采用超聲波輔助提取，響應面法優(yōu)化提取工藝條件。先選擇影響提取率較大的3個因素：超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗；得到各單因素提取總黃酮的較優(yōu)條件范圍，將優(yōu)化后的參數(shù)進行響應面分析，建立二次多元回歸模型方程。利用回歸方程，得到提取雞血藤總黃酮的最佳工藝參數(shù)為超聲時間40 min，料液比1∶52，乙醇體積分數(shù)41%，在此條件下實際測得雞血藤總黃酮的提取率為6.19%。