肖正鳳

(陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西 西安 710062)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)被認(rèn)為是最常見(jiàn)的一種癡呆形式，是一種進(jìn)行性神經(jīng)障礙，其特征是記憶力喪失和其他智力能力的嚴(yán)重?fù)p害[1]。關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的學(xué)說(shuō)有不少，其中最為廣泛接受的是“膽堿能假說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為AD與乙酰膽堿(ACh)的降低水平和腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的丟失有關(guān)[2]。因此，通過(guò)增加腦內(nèi)乙酰膽堿水平、改善膽堿能系統(tǒng)的是治療AD的重要方法。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，一種能將神經(jīng)遞質(zhì)ACh分解成乙酸和膽堿的酶，阻礙正常的神經(jīng)傳遞，在調(diào)控膽堿能系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。阿爾茨海默病的膽堿能假說(shuō)指出，抑制AChE作用可能是治療阿爾茨海默病癥狀重要方法之一?；诖耍?-甲氧基他林(7-methoxytacrine)、多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)及石杉?jí)A甲(huperzineA)等多個(gè)AChE抑制劑已被研制成功，并投入臨床用于調(diào)節(jié)和控制AChE的活性及預(yù)防和治療阿爾茨海默病，成為目前治療阿爾茨海默病的主要藥物[4]。但是目前已投入臨床中的抑制劑對(duì)于改變重度阿爾茨海默病患者的癥狀效果不佳，同時(shí)存在選擇性低、副作用較大等問(wèn)題。因此，尋找能夠有效抑制AChE活性、選擇性好、副作用小的新型天然產(chǎn)物，并探討它們的抑制作用及機(jī)理，對(duì)于研發(fā)治療阿爾茨海默病的藥物和了解AChE抑制劑發(fā)揮藥效的作用機(jī)制具有重要意義。

芫花素(genkwanin)又叫芫花黃素，為淡黃色針狀結(jié)晶，屬于黃酮類(lèi)化合物，其成分來(lái)源為瑞香科植物芫花。據(jù)我國(guó)藥典記載，芫花具有解毒殺蟲(chóng)、瀉水逐飲的功效；內(nèi)治痰飲積聚、氣逆喘咳、水腫脹滿、胸腹積水、二便不利，外治疥癬禿瘡、凍瘡[8]。現(xiàn)代藥理研究表明，芫花素具有多種藥理活性，例如抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)咳祛痰、保護(hù)腦缺血神經(jīng)損傷及心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷、降血壓、抗焦慮、抗菌、抗病毒以及抗氧化調(diào)節(jié)免疫功能等作用[9-11]。

本文發(fā)現(xiàn)芫花素對(duì)AChE的活性具有一定的抑制作用，探討了芫花素與AChE的相互作用，并采用酶抑制動(dòng)力學(xué)研究了其抑制機(jī)理，旨在于為建立芫花素與AChE結(jié)合的體外模型、揭示芫花素抑制體內(nèi)生物學(xué)作用機(jī)制及利用、設(shè)計(jì)或開(kāi)發(fā)新藥等提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

試劑：eeAChE(來(lái)源于電鰩)、碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)及聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)，美國(guó)Sigma公司；芫花素，中國(guó)食品藥品檢定研究院；二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、乙醇、磷酸氫二鈉均購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

儀器：PE Lambda35型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)PerkinElmer公司；pH數(shù)顯酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液。用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.17 mg/mL的AChE貯備液，冷凍儲(chǔ)存，使用時(shí)用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度；用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.87×10-3mol·L-1的碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)貯備液，用時(shí)稀釋至所需濃度；用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.25×10-3mol·L-1的聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋至所需濃度。用二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為1×10-2mol·L-1芫花素儲(chǔ)備液。

1.2.2 芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用

按照Ellmann法[12]檢測(cè)AChE的活性。在25 ℃下，pH=7.5，0.01 mol·L-1PBS中，以碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)為底物。酶促反應(yīng)的產(chǎn)物硫代膽堿與聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)發(fā)生反應(yīng)，其產(chǎn)物為黃色化合物的5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)。TNB在412 nm處的摩爾消光系數(shù)ε為14150 L·mol-1·cm-1，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定TNB在412 nm處的吸光值[13]。

未加抑制劑AChE活性的測(cè)定：在1 mL比色管中加入515.6 μL PBS緩沖溶液、8 μL的AChE使用液(2.34 μg·mL-1)、7 μL的DMSO及160 μL DTNB使用液(1.25 mmol·L-1)，將于25 ℃水浴中恒溫20 min，然后加入9.4 μL碘化硫代乙酰膽堿使用液(1.87 mmol·L-1)，搖勻并置于25 ℃水浴中恒溫1 min，在波長(zhǎng)412 nm處并以蒸餾水為參比溶液，測(cè)其吸光度值(Acontrol)。以PBS緩沖溶液(0.01 mol·L-1)代替AChE使用液(2.34 μg·mL-1)做空白實(shí)驗(yàn)，重復(fù)上述步驟，測(cè)得空白值A(chǔ)0。

加入抑制劑AChE活性測(cè)定：在1 mL比色管中加入8 μL AChE使用液的同時(shí)加入一定量的芫花素使用液，根據(jù)加入的芫花素使用液體積調(diào)整PBS緩沖溶液的體積使總體積保持為700 μL，其它步驟與未加抑制劑AChE活性的測(cè)定相同，在波長(zhǎng)412 nm處并以蒸餾水為參比溶液，測(cè)得加入一定量芫花素抑制劑后的吸光度值A(chǔ)。按照下式計(jì)算加入芫花素后的相對(duì)酶活力：

(1)

式(1)中：ΔAcontrol是未加芫花素抑制劑時(shí)測(cè)得的校正吸光度值；ΔAcontrol=Acontrol-A0；ΔA是加入芫花素后酶催化反應(yīng)的校正吸光度值，ΔA=A-A0。

1.2.3 芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶的動(dòng)力學(xué)特征

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)得5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)吸光度值A(chǔ)的變化反映了AChE催化反應(yīng)產(chǎn)物硫代膽堿濃度的變化。在不同芫花素濃度(0，5，10和15 μmol·L-1)下，固定催化反應(yīng)溫度為25 ℃，AChE的濃度為3.82×10-10mol·L-1，在AChE催化反應(yīng)線性區(qū)間內(nèi)，每間隔一定的時(shí)間，測(cè)定不同底物濃度(2.5，4，5，8，10，20和40 mmol·L-1)時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物硫代膽堿與顯色劑DTNB生成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸的吸光度值A(chǔ)。用time(AChE催化反應(yīng)時(shí)間)～A(測(cè)得的吸光度值)作圖，得到的直線斜率反映了AChE催化反應(yīng)的速率v[14-15]，接著按照 Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)作圖法，可確定抑制作用的類(lèi)型。

2 結(jié)果與討論

2.1 AChE催化反應(yīng)進(jìn)程

固定AChE的濃度為3.82×10-10mol·L-1，硫代乙酰膽堿的初始濃度為2.51×10-5mol·L-1，記錄412 nm處吸光度值隨時(shí)間的變化，測(cè)得無(wú)抑制劑存在時(shí)和分別加入不同濃度的芫花素后AChE催化硫代乙酰膽堿分解的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，吸光度值A(chǔ)隨時(shí)間的變化曲線為過(guò)原點(diǎn)的直線，直線的斜率反映AChE催化反應(yīng)的初速率v，可代表酶活。加入芫花素抑制劑后，直線的斜率變小，AChE催化反應(yīng)速率隨著芫花素的濃度增加而降低，單位時(shí)間內(nèi)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸的量減少，說(shuō)明芫花素對(duì)AChE的催化活性具有抑制作用。

圖1 加入不同濃度的芫花素后對(duì)AChE的催化反應(yīng)速率的影響

2.2 芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶活力的抑制作用

由圖1中每條直線的斜率與無(wú)抑制劑存在時(shí)直線的斜率的比值求得相對(duì)酶活力，作出了圖2，此圖體現(xiàn)了不同濃度的芫花素對(duì)AChE活性的影響。由圖2可知，隨著芫花素濃度的增加，AChE的相對(duì)酶活力逐漸降低。當(dāng)芫花素的濃度在0～10 μmol·L-1范圍時(shí)，相對(duì)酶活力與加入的芫花素濃度之間呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r>0.99)，線性擬合曲線為：相對(duì)酶活力=-0.054c(genkwanin)+0.9839。根據(jù)該線性擬合曲線求得50%抑制濃度(IC50)，即導(dǎo)致AChE酶活力下降50%所需的芫花素濃度為8.96 μmol·L-1，此結(jié)果表明AChE的活性受到芫花素的抑制，且抑制作用較強(qiáng)。因此芫花素可作為一種用來(lái)篩選AChE的抑制劑的參考配體。

圖2 芫花素對(duì)AChE活性的影響

2.3 芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶活力的抑制動(dòng)力學(xué)

為了進(jìn)一步明確芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制作用的機(jī)理，在測(cè)定酶活體系中，固定酶的濃度為3.82×10-10mol·L-1，在不同的芫花素濃度下，改變?cè)囈旱牡孜锏饣虼阴Ｄ憠A(ATChI)濃度([S])，測(cè)得這些試液的吸光度隨時(shí)間的變化情況，從直線的斜率得到AChE催化反應(yīng)的初速率v，再根據(jù)底物濃度([S])與初速率v作圖，得到米氏(Michaelis-Menten)曲線(如圖3所示)。由圖3可知，酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)符合米氏(Michaelis-Menten)方程，因此可進(jìn)一步研究芫花素對(duì)AChE的抑制類(lèi)型。

圖3 不同濃度芫花素下AChE的米氏曲線

在可逆抑制類(lèi)型中，根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關(guān)系，又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合型抑制四種類(lèi)型，可通過(guò)雙倒數(shù)作圖(Lineweaver-Burk作圖法)進(jìn)行判斷[16]。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法即以不同的芫花素濃度下測(cè)得的AChE催化反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/[v])對(duì)底物濃度的倒數(shù)(1/[S])作圖，如圖4所示。

圖4 芫花素對(duì)AChE抑制作用的雙倒數(shù)圖

由圖4可知，無(wú)抑制劑存在時(shí)和加入不同濃度的芫花素后，得到的幾條相交于第二象限的直線。因加入不同濃度的芫花素，這些直線與橫軸和縱軸的交點(diǎn)都不同。本實(shí)驗(yàn)條件下，無(wú)抑制劑存在時(shí)AChE催化硫代酰膽堿分解的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線為：

(2)

根據(jù)公式(2)的斜率和截距計(jì)算出在溫度為25 ℃時(shí)乙酰膽堿酯酶表觀米氏常數(shù)Km為0.062 mmol·L-1，酶促反應(yīng)的最大速率Vmax為0.962 mmol·L-1·min-1。圖4可知乙酰膽堿酯酶的表觀米氏常數(shù)(Km)隨著芫花素濃度增大而增大，而酶促反應(yīng)的最大速率(Vmax)隨著芫花素濃度增大而減小。因此根據(jù)酶的可逆抑制動(dòng)力學(xué)特征判斷[16]，芫花素對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用機(jī)理表現(xiàn)為混合Ⅰ型競(jìng)爭(zhēng)抑制。混合型抑制結(jié)果表明，芫花素既可以和游離酶(E)結(jié)合，也可以與酶-底物復(fù)合物(ES)結(jié)合，導(dǎo)致酶活力降低。

用抑制劑存在下的表觀米氏常數(shù)Km或雙倒數(shù)圖斜率(簡(jiǎn)稱(chēng)一次作圖斜率)對(duì)抑制劑濃度作圖即兩次作圖法可求得抑制常數(shù)KI。因此，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中直線的斜率對(duì)芫花素濃度作圖，得到圖5。圖5中直線的反向延長(zhǎng)線與X軸的交點(diǎn)即為芫花素對(duì)AChE的抑制常數(shù)的相反數(shù)，由此求得芫花素對(duì)AChE的抑制常數(shù)KI=5.77×10-6mol·L-1。又以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中直線與Y軸的截距對(duì)芫花素濃度作圖，如圖6所示，圖中直線的反向延長(zhǎng)線與X軸的交點(diǎn)即為芫花素對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)的相反數(shù)，由此求得芫花素對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)KIS=31.11×10-6mol·L-1，KIS值約為KI值的5.39倍，由此可知抑制常數(shù)KIS>KI，說(shuō)明競(jìng)爭(zhēng)性抑制強(qiáng)于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即芫花素對(duì)游離酶的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)酶-底物復(fù)合物的抑制作用[17]。這種抑制類(lèi)型往往是由于配體與酶的結(jié)合部位是對(duì)酶活性起重要作用的其它活性位點(diǎn)，而不是酶的活性中心。

圖5 芫花素對(duì)AChE抑制常數(shù)KI的測(cè)定

圖6 芫花素對(duì)AChE抑制常數(shù)KIS的測(cè)定

3 結(jié) 論

芫花素對(duì)AChE的抑制作用研究結(jié)果表明，加入芫花素后，酶催化反應(yīng)速率顯著降低。芫花素對(duì)AChE抑制作用的IC50為 8.96 μmol·L-1。芫花素對(duì)AChE的抑制作用表現(xiàn)為混合Ⅰ型的可逆抑制，芫花素對(duì)游離酶的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)酶-底物復(fù)合物的抑制作用。本文的研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步深入研究芫花素對(duì)AChE抑制作用的機(jī)理提供了依據(jù)。