繆標(biāo)烈，毛興敏，劉增輝，陳仁春

(粵北第二人民醫(yī)院骨外科，廣東 韶關(guān) 512028)

骨結(jié)核感染及發(fā)病十分隱匿，給臨床診斷帶來(lái)極大的困難，目前能夠簡(jiǎn)便、快速診斷結(jié)核病的方法卻十分有限，很多患者因?yàn)闆](méi)有得到早期治療而致殘、致畸[1]?；仡櫸墨I(xiàn)顯示[2]，TuliⅠ期骨關(guān)節(jié)結(jié)核在治療后關(guān)節(jié)功能得到完全恢復(fù)或部分受損，TuliⅡ期骨關(guān)節(jié)結(jié)核接受治療關(guān)節(jié)功能可保留50%～70%，因此尋求一種能夠早期、快速運(yùn)用于骨結(jié)核診斷的方法成為當(dāng)務(wù)之急。目前國(guó)內(nèi)大部分醫(yī)院主要是應(yīng)用結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)(pure protein derivative，PPD試驗(yàn))、抗結(jié)核抗體(tuberculosis antibody，TB-ab)及病原學(xué)檢查等傳統(tǒng)檢測(cè)輔助診斷骨結(jié)核，臨床應(yīng)用過(guò)程發(fā)現(xiàn)PPD皮試及TB-ab的靈敏度、特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較低，病原學(xué)檢查雖然有高特異度，但等待結(jié)果時(shí)間太長(zhǎng)，靈敏度也較低[3-4]。近年來(lái)有學(xué)者將核酸擴(kuò)增檢測(cè)法(Xpert MTB/RIF)用于輔助診斷結(jié)核病，獲得較高的靈敏度和特異度。竺祖軍等[5]通過(guò)手術(shù)或穿刺獲得含菌的病灶組織或膿液，應(yīng)用于Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷骨結(jié)核病，靈敏度達(dá)到82.0%，特異度為96.67%，與董偉杰等[6]研究結(jié)果基本一致，獲得較好的臨床效果。但劉佳慶等[7]卻發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核菌涂陰的患者中Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度僅為56.5%，認(rèn)為Xpert MTB/RIF檢測(cè)要獲得滿意的臨床效果要求檢測(cè)標(biāo)本含菌量達(dá)到其檢測(cè)限值。而早期骨結(jié)核大部分為結(jié)核菌涂陰患者，且大多無(wú)需手術(shù)，獲得充足含菌量的標(biāo)本有較大難度，使用Xpert MTB/RIF檢測(cè)出現(xiàn)假陰性概率大，陽(yáng)性率低。近年國(guó)外有學(xué)者將結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T cell spot test of tuberculosis infection，TSPOT.TB)應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，獲得較高的靈敏度和特異度。TSPOT.TB檢測(cè)標(biāo)本為外周血，并且支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等多種標(biāo)本同樣具有檢測(cè)價(jià)值，取材簡(jiǎn)便且具有多樣化，無(wú)需帶菌標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，大大提高了陽(yáng)性率，臨床應(yīng)用價(jià)值大，易推廣。目前國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道將TSPOT.TB應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷，獲得滿意的臨床效果，但將其應(yīng)用于診斷早期骨結(jié)核的報(bào)道少見(jiàn)，把該檢測(cè)與傳統(tǒng)診斷骨結(jié)核的方法做比較的研究更少見(jiàn)，暫無(wú)明確數(shù)據(jù)表明其診斷早期骨結(jié)核的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究將80例疑似早期骨結(jié)核病例作為研究對(duì)象，通過(guò)TSPOT.TB檢測(cè)并與傳統(tǒng)診斷方法進(jìn)行對(duì)比分析，探討其輔助診斷早期骨結(jié)核的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集粵北第二人民醫(yī)院2017年7月至2018年12月收治的疑似TuliⅠ期及Ⅱ期骨結(jié)核病例80例行前瞻性研究，其中男43例，女37例；年齡10～75歲，平均年齡(45.25±7.62)歲。所有病例均行PPD皮試、TB-ab檢測(cè)、結(jié)核菌病原學(xué)檢查及TSPOT.TB檢測(cè)。通過(guò)病灶穿刺獲得組織，行病理檢查(金標(biāo)準(zhǔn))確診后獲得52例骨結(jié)核病例歸類(lèi)為A組，非骨結(jié)核病28例歸類(lèi)為B組。本研究過(guò)程符合赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均自愿簽署臨床研究知情同意書(shū)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)疑似Tuli分期Ⅰ期及Ⅱ期骨結(jié)核患者；(2)無(wú)免疫缺陷疾??；(3)同意參加本次研究并配合完善相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有明確的免疫缺陷疾?。?2)有嚴(yán)重的終末期疾病患者；(3)近期有大量使用激素的患者。

1.3 方法 所有病例行PPD皮試、TB-ab檢測(cè)、結(jié)核菌病原學(xué)檢查及TSPOT.TB檢測(cè)。將病理檢查作為骨結(jié)核診斷金標(biāo)準(zhǔn)，骨結(jié)核病例歸類(lèi)為A組，非骨結(jié)核病歸類(lèi)為B組，觀察兩組病例的PPD皮試、TB-ab檢測(cè)、病原學(xué)檢查及TSPOT.TB的靈敏度、特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.3.1 TB-ab檢測(cè) 本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSIA法)取血清按試劑盒(上海奧普公司)說(shuō)明進(jìn)行TB-ab檢測(cè)。結(jié)果判斷：樣本的吸光值/臨界對(duì)照品的吸光度值的比值>6為陽(yáng)性，比值<6為陰性。

1.3.2 PPD皮試 將PPD 0.1 mL原液在前臂掌側(cè)前1/3行皮內(nèi)注射并標(biāo)記皮丘位置。72 h后觀察皮丘，無(wú)硬結(jié)或硬結(jié)<5 mm為(-)，不發(fā)紅且硬結(jié)直徑≥5 mm提示(+)。

1.3.3 TSPOT.TB檢測(cè) TSPOT.TB檢測(cè)是采用γ-干擾素釋放原理，結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，對(duì)機(jī)體結(jié)核桿菌感染進(jìn)行檢測(cè)的方法。其設(shè)有陰性參照孔、早期抗原靶6(early stage antigen targe-6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(ulture filtrate protein-10，CFP-10)作為刺激源的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)孔及以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)作為刺激源的陽(yáng)性參照孔(見(jiàn)圖1)。實(shí)驗(yàn)方法：用含肝素鋰的試管采集外周靜脈血4～5 mL，進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離、洗滌及計(jì)數(shù)并配制細(xì)胞懸液，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行體外抗原刺激與孵育，洗板顯色后進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀和計(jì)數(shù)。達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)判定為陽(yáng)性：(1)當(dāng)陰性參照孔斑點(diǎn)數(shù)<5個(gè)，任意一個(gè)實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性參照孔斑點(diǎn)數(shù)需≥6個(gè)。(2)當(dāng)陰性參照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，任意一個(gè)實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)必須是陰性參照孔斑點(diǎn)數(shù)的2倍以上。

圖1 TSPOT.TB檢測(cè)示意圖

1.3.4 結(jié)核菌病原學(xué)檢查[8]局麻下對(duì)病灶進(jìn)行穿刺，獲得病變組織，按檢驗(yàn)要求行改良羅氏結(jié)核桿菌培養(yǎng)及標(biāo)本直接涂片；結(jié)核菌培養(yǎng)有結(jié)核菌生長(zhǎng)并經(jīng)顯微鏡下鏡檢證實(shí)視為陽(yáng)性(見(jiàn)圖2～3)；涂片結(jié)果按萋-尼氏抗酸染色法進(jìn)行判讀，鏡下找到結(jié)核菌視為陽(yáng)性(見(jiàn)圖4)。本研究將結(jié)核菌涂片及結(jié)核菌培養(yǎng)兩種檢查統(tǒng)一歸類(lèi)為結(jié)核菌病原學(xué)檢查。病理檢查作為診斷新標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)圖5)。

圖2 結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性

圖4 結(jié)核菌抗酸染色涂片陽(yáng)性(萋-尼氏染色法，×100油鏡)

1.4 觀察指標(biāo) 記錄兩組患者TSPOT.TB檢測(cè)、PPD皮試、TB-ab檢測(cè)、結(jié)核菌病原學(xué)檢查的陽(yáng)性及陰性病例數(shù)，計(jì)算以上檢測(cè)在早期骨結(jié)核診斷中的靈敏度、特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，進(jìn)行對(duì)比分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用ROC曲線分析PPD皮試、TB-ab、結(jié)核菌病原學(xué)檢查及TSPOT.TB在早期骨結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié) 果

PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學(xué)檢查在骨結(jié)核診斷中的結(jié)果(見(jiàn)表1～2，見(jiàn)圖6)，提示TSPOT.TB在早期骨結(jié)核診斷中有較高靈敏度、特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，TSPOT.TB診斷早期骨結(jié)核的靈敏度顯著高于PPD皮試、TB-ab和結(jié)核菌病原學(xué)檢查(χ2值分別為7.385，29.352，35.455，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSPOT.TB診斷骨結(jié)核的特異度顯著高于PPD皮試、TB-ab(χ2值分別為14.275和9.524，P=0.015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSPOT.TB診斷骨結(jié)核的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著高于PPD皮試、TB-ab(χ2值分別為11.778和19.665，P=0.035)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSPOT.TB診斷骨結(jié)核特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值稍低于結(jié)核菌病原學(xué)檢查(χ2值分別為2.074和0.660，P值分別為0.150和0.417)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學(xué)檢查預(yù)測(cè)值(%)

圖6 四種檢測(cè)之間靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值對(duì)比圖

繪制PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學(xué)檢查在骨結(jié)核診斷中的ROC曲線圖(見(jiàn)圖7)。其中TSPOT.TB檢測(cè)ROC曲線下面積為0.902，PPD皮試的ROC曲線下面積為0.796，TB-ab檢測(cè)ROC曲線下面積為0.725，病原學(xué)檢查ROC曲線下面積為0.587，TSPOT.TB診斷骨結(jié)核的ROC曲線下面積最大，診斷價(jià)值最高。

圖7 四種檢查方法診斷骨結(jié)核ROC曲線圖

3 討 論

目前對(duì)于早期骨結(jié)核診斷方面臨床仍無(wú)良好的診斷方法，特別是在貧困地區(qū)基層醫(yī)院，診斷方法單一、診斷方法復(fù)雜，無(wú)簡(jiǎn)單、快速、可靠的輔助診斷和篩查方法，導(dǎo)致大部分骨結(jié)核患者在早期沒(méi)有得到及時(shí)治療而致殘、致畸，給患者身體上帶來(lái)巨大痛苦。

PPD皮試、TB-ab及病原學(xué)檢查等傳統(tǒng)輔助診斷結(jié)核的方法應(yīng)用于臨床已有幾十年的歷史，但在臨床結(jié)核診斷上的總體表現(xiàn)欠佳，并未達(dá)到預(yù)期的診斷效果[9]。TSPOT.TB是檢測(cè)結(jié)核桿菌抗原刺激下外周血或全血的單核細(xì)胞釋放γ干擾素的水平，對(duì)診斷結(jié)核感染有重要臨床價(jià)值[10-11]。國(guó)外已經(jīng)將TSPOT.TB應(yīng)用于肺結(jié)核診斷當(dāng)中，并取得了良好應(yīng)用效果，但國(guó)內(nèi)應(yīng)用TSPOT.TB進(jìn)行早期骨結(jié)核診斷的研究報(bào)道很少，其應(yīng)用價(jià)值尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)[12]。本研究通過(guò)將TSPOT.TB檢測(cè)與多種傳統(tǒng)診斷早期骨結(jié)核的方法進(jìn)行對(duì)比，研究結(jié)果顯示TSPOT.TB在診斷TuliⅠ期及Ⅱ期骨結(jié)核感染有較高的敏感度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，ROC曲線下面積達(dá)到0.902，診斷價(jià)值明顯優(yōu)于傳統(tǒng)診斷方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示以TSPOT.TB診斷骨結(jié)核有助于提升診出率。Broderick等[13]國(guó)外學(xué)者曾以31例肺外結(jié)核患者為例，對(duì)TSPOT.TB診斷肺外結(jié)核的價(jià)值展開(kāi)前瞻性研究，研究結(jié)果顯示TSPOT.TB診斷肺外結(jié)核的靈敏度達(dá)到100%。李曉等[14-15]研究結(jié)果顯示TSPOT.TB診斷骨結(jié)核的敏感性為96%，且靈敏度不受人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染影響。梁大華等[16-18]國(guó)內(nèi)學(xué)者在研究中報(bào)道TSPOT.TB 在結(jié)核診斷中的敏感性達(dá)到94.21% 、特異性達(dá)到94.50%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到74.20%[19-20]。上述研究結(jié)果均與本次研究結(jié)果相近，充分證實(shí)本次研究結(jié)果可靠。

Zhou Zibo等[21]對(duì)TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨結(jié)核中的診斷價(jià)值進(jìn)行了比較分析；TSPOT.TB的靈敏度(89.7%)顯著高于Xpert MTB/RIF檢測(cè)(74.4%，P<0.05)；Xpert MTB/RIF分析的特異性(97.1%)高于T-SPOT.TB(82.4%，P<0.05)。雖然兩種檢測(cè)靈敏度和特異度各有優(yōu)勢(shì)，但Xpert MTB/RIF和TSPOT.TB的ROC曲線下面積分別為0.857和0.860，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨結(jié)核診斷中具有同等價(jià)值。Xpert MTB/RIF檢測(cè)獲得較高的特異度要求標(biāo)本含菌并達(dá)到其檢測(cè)限值，早期骨結(jié)核要獲得含菌量高的標(biāo)本較難；而TSPOT.TB檢測(cè)標(biāo)本范圍廣泛，不僅局限于血液標(biāo)本，對(duì)支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等多種標(biāo)本同樣具有檢測(cè)價(jià)值，能夠應(yīng)用多種標(biāo)本對(duì)結(jié)核病做出診斷[22]。TSPOT.TB檢測(cè)標(biāo)本多樣提升了骨結(jié)核診斷準(zhǔn)確性，也決定了TSPOT.TB檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)勢(shì)。本次研究中未涉及非血液標(biāo)本檢測(cè)。

盡管TSPOT.TB試驗(yàn)診斷骨結(jié)核具有優(yōu)勢(shì)，但也存在不足，TSPOT.TB檢測(cè)所需試劑盒價(jià)格昂貴，對(duì)檢測(cè)操作技術(shù)的要求也很高，必須配備相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，導(dǎo)致此技術(shù)全面推廣難度大，無(wú)法在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。優(yōu)化TSPOT.TB檢測(cè)技術(shù)，推行醫(yī)聯(lián)體合作以減少醫(yī)療成本和檢測(cè)費(fèi)用，是促進(jìn)TSPOT.TB檢測(cè)技術(shù)推廣應(yīng)用的有效策略。

綜上所述，TSPOT.TB檢測(cè)診斷早期骨結(jié)核具有較高敏感度、特異度，且具有檢測(cè)安全、快速、可靠等優(yōu)勢(shì)，值得臨床推廣應(yīng)用，但檢測(cè)成本高使其應(yīng)用受到限制。相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展、新醫(yī)改的推行，TSPOT.TB檢測(cè)成本將不斷降低，有望實(shí)現(xiàn)TSPOT.TB檢測(cè)的推廣應(yīng)用。