楊秀偉，周琪樂(lè)

北京大學(xué) 藥學(xué)院/天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

紅參Ginseng Radix et Rhizoma Rubra是五加科多年生草本植物人參PanaxginsengC. A. Mey.的根和根莖經(jīng)蒸制成的產(chǎn)品，馳名中外。人參根和根莖含有獨(dú)特的四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型三萜[1-5]，經(jīng)蒸制后許多成分發(fā)生了化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[6-9]，藥性亦發(fā)生了改變[9]。本課題組前期研究報(bào)道了紅參中人參皂苷的定量分析[10]，本實(shí)驗(yàn)研究人口服紅參后，其中的人參皂苷在人尿液中的排泄。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括Nexera X2 UFLC液相系統(tǒng)：LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A檢測(cè)器、CTO-20AC柱溫箱；8050型三重四級(jí)桿定量質(zhì)譜：配備ESI離子源和LabSolution工作站；Mettler XS105DU十萬(wàn)分之一電子天平(METTLER TOLEDO，Zurich，Switzerland)；AR4120型萬(wàn)分之一電子天平[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ5200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz)。

1.2 試藥

紅參(批號(hào)：20131201JLRG)水提取物(批號(hào)：PG-Y-201606)由長(zhǎng)春加一健康食品有限公司提供，主要制備方法[6]：干燥的紅參粗粉(10 kg)用沸水提取3次，每次80 L，提取4 h；合并提取液，減壓濃縮得干膏4.65 kg。

對(duì)照品人參皂苷(G)：20(S)-G-Rh1(1)、G-Rd (2)、G-Rk3(3)、G-Rh4(4)、20(S)-G-Rg3(5)、20(R)-G-Rg3(6)，20(S)-原人參三醇(PPT)(7)、20(R)-PPT (8)、G-化合物(C)-K (9)和20(S)-原人參二醇(PPD)(10) 系本課題組從紅參[6]或人參莖葉總皂苷酸水解產(chǎn)物[11]中分離制備，純度經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)測(cè)定均大于98%。以上10個(gè)對(duì)照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 10個(gè)對(duì)照品(以及口服紅參水提取物后在人尿液中監(jiān)測(cè)到的這些化合物)的結(jié)構(gòu)

LC-MS級(jí)別乙腈和甲醇(Fisher Scientific Inc.)；色譜純級(jí)別乙腈和甲醇(天津西華特種試劑廠)；超純水(18 MΩ/cm)為本實(shí)驗(yàn)室用Milli-Q Advantage A10 (Millipore，Billerica，USA)制水機(jī)自制；HPLC級(jí)別乙酸銨(Sigma-Aldrich公司)。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

液質(zhì)分析C18色譜柱為Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；預(yù)柱Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18VanGuardTMPre-Column (5 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相為0.1 mmol·L-1醋酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度洗脫方式，梯度洗脫(0～4 min，72%～67%A；4～6 min，67%～61%A；6～6.1 min，61%～58%A；6.1～13 min，58%～53%A)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)：霧化氣流速為3 L·min-1；干燥氣流速為10 L·min-1；加熱氣流速為10 L·min-1；接口加熱器溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測(cè)器電壓為1.80 kV。電離源為電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)。

選擇監(jiān)測(cè)的10個(gè)化合物及內(nèi)標(biāo)地高辛(digoxin)的MRM離子對(duì)、滯留時(shí)間(dwell time)、Q1和Q3能量、碰撞能量(CE)見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定的10個(gè)三萜成分及內(nèi)標(biāo)(地高辛)的質(zhì)譜MRM參數(shù)

2.2 儲(chǔ)備液及工作溶液的配制

精密稱(chēng)取上述10個(gè)對(duì)照品各適量，分別精密加入LC-MS級(jí)甲醇配制成1.0 mg·mL-1的儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)化合物地高辛適量，加入LC-MS級(jí)甲醇配制成1.0 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。制備標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，以甲醇將儲(chǔ)備液稀釋成一系列工作溶液，密封，置4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 混合對(duì)照品溶液的配制

分別移取適量?jī)?chǔ)備液混合并稀釋制成混合對(duì)照品母液。連續(xù)稀釋混合對(duì)照品母液得到一系列混合對(duì)照品線性工作液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

分別對(duì)分析方法的專(zhuān)屬性、系統(tǒng)適用性、線性、檢測(cè)下限和定量下限、重復(fù)性、提取回收率和穩(wěn)定性進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法能夠用于上述10個(gè)分析物的含量測(cè)定(數(shù)據(jù)略)。各待測(cè)化合物的內(nèi)標(biāo)校正曲線的線性范圍和回歸方程見(jiàn)表2。

2.5 口服紅參提取物

成年人(62 kg體質(zhì)量，男，55周歲)口服紅參提取物2 g(相當(dāng)于4.30 g紅參)，然后分別在0～3、3～6、6～12、12～24 h收集尿液，尿液經(jīng)過(guò)濾后，加入甲醇-乙腈(3∶1)沉淀離心后，收集上清液待進(jìn)一步處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜行為

在選定的色譜條件下，10個(gè)人參皂苷類(lèi)化合物和內(nèi)標(biāo)地高辛的保留時(shí)間見(jiàn)表1；MRM圖譜顯示無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)其干擾，口服紅參水提取物后各時(shí)間段人尿液樣品對(duì)應(yīng)的10個(gè)化合物的MRM圖譜見(jiàn)圖2。

3.2 人尿液中10個(gè)人參皂苷類(lèi)成分含量

人口服紅參水提取物后各時(shí)間段尿液中能檢測(cè)到的10個(gè)化合物的絕對(duì)含量見(jiàn)表3。

表2 各待測(cè)分析物的內(nèi)標(biāo)校正曲線的線性范圍和回歸方程 ng·mL-1

圖2 人口服紅參提取物后各時(shí)間段尿液的MRM圖譜

表3 人口服紅參水提取物后各時(shí)間段尿液中10個(gè)化合物的絕對(duì)含量 ng

4 討論

在人口服紅參水提取物后24 h排泄的尿液中能檢測(cè)到10個(gè)人參三萜類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1?；衔?、5、6、9和10為二醇型達(dá)瑪烷三萜，化合物1、3、4、7和8為三醇型達(dá)瑪烷三萜。表3中的10個(gè)分析物中，除G-C-K在紅參水提取物中不存在外，其他9個(gè)人參三萜類(lèi)化合物在紅參水提取物[6，10]中均存在，盡管如此，本研究結(jié)果也不能排除它們是某個(gè)或某些人參皂苷在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，如：已有研究顯示，志愿受試者口服G-Re(200 mg)，在尿液中可檢測(cè)到原形化合物G-Re及其代謝產(chǎn)物G-Rg1、G-F1、G-Rh1和PPT[12]，說(shuō)明G-Re在體內(nèi)可代謝為G-Rh1，后者經(jīng)尿液排泄。證明G-C-K肯定是作為人參皂苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)代謝產(chǎn)生，經(jīng)尿液排泄。在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為G-C-K的紅參中的皂苷，可能包括二醇型達(dá)瑪烷三萜G-Ra1、G-Ra2、G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc、G-Rd、西洋參皂苷-R1(quinquenoside-R1，Q-R1)[6，10]以及相關(guān)的中間代謝產(chǎn)物，見(jiàn)圖3。因此，G-C-K可能以較高的血藥濃度出現(xiàn)在體循環(huán)中。生物活性研究表明，G-C-K能改善腦缺血再灌注損傷，具有抗炎活性，能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵入和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及提高化療藥物對(duì)其敏感性，減輕其對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用等途徑而表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用[13]。這些結(jié)果一方面提示，紅參中多樣性化學(xué)結(jié)構(gòu)的一些皂苷，在體內(nèi)可代謝為同一代謝產(chǎn)物G-C-K，使其血藥濃度提高，更好地發(fā)揮作用；另一方面提示能代謝為G-C-K的原形紅參皂苷，可能是紅參的質(zhì)量標(biāo)志物。G-C-K繼續(xù)水解掉C-20的葡萄糖基，可代謝為20(S)-PPD[14]，20(S)-PPD也是生物活性物質(zhì)[13]。

在紅參三醇型達(dá)瑪烷三萜皂苷中，如G-Re、G-Rf、G-Rg1、G-Rg2、G-Rh1、三七皂苷(notoginsenoside)-R1和R2[6，10]等逐級(jí)水解掉糖基，代謝為PPT[14]；C-20差向異構(gòu)化，PPT存在20(S)-PPT和20(R)-PPT平衡形式，它們也是生物活性物質(zhì)[13，15]。如果G-Re代謝脫去C-20位的葡萄糖基和C-6位糖鏈末端的鼠李糖基轉(zhuǎn)化為G-Rh1[14]，甚至代謝到PPT，則對(duì)細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator two homolog 1,SIRT 1)激活作用增強(qiáng)[15]，有利于紅參發(fā)揮延緩人衰老的作用。

圖3 紅參中可能轉(zhuǎn)化為G-C-K的皂苷

本研究結(jié)果證明，紅參含有的某些人參皂苷類(lèi)成分可在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為生物活性更強(qiáng)的物質(zhì)，它們是前藥(pro-drug)。