董鮮，李晴晴，霍瑩瑩，陳傳嬌，曾子盈，2，段素素，2，馬玉楠，程永現(xiàn)，2*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東 深圳 518060

植物與動(dòng)物不同，動(dòng)物當(dāng)面臨不利環(huán)境時(shí)可以直接逃走，也正因此，植物進(jìn)化出獨(dú)特的防御策略，以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境對(duì)其造成的威脅。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，為了彌補(bǔ)其的不動(dòng)性，能與生物環(huán)境相互作用，形成了不同的防御機(jī)制[1]，包括主動(dòng)和被動(dòng)防御機(jī)制[2]。植物為保護(hù)自己免受食草動(dòng)物和病原體的侵害，能產(chǎn)生大量的次生化學(xué)物質(zhì)，其中一些化學(xué)物質(zhì)一直被用于病蟲(chóng)害防治[3]。植物形成的“抗生素”得到最多關(guān)注的是植保素[4]。

植物病害嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)的良性發(fā)展。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為保證栽培作物的產(chǎn)量，大量化學(xué)殺菌劑的施用已成一種常規(guī)[5]。雖然短期內(nèi)能提高經(jīng)濟(jì)效益，但由此引發(fā)的更為嚴(yán)重的問(wèn)題不可忽視，如：土壤污染、農(nóng)藥殘留、致病菌抗性增強(qiáng)、新的突變菌株產(chǎn)生、有益微生物被毒殺、微生態(tài)失衡等。盡管公眾普遍關(guān)注合成農(nóng)藥對(duì)健康和環(huán)境的長(zhǎng)期影響，但由于天然生物農(nóng)藥生產(chǎn)成本高、開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)等瓶頸問(wèn)題，其尚未在市場(chǎng)上占據(jù)較大份額。植物源殺菌劑的毒性和殘留量都很低，對(duì)環(huán)境、動(dòng)物和人類大多是友好的。植物源農(nóng)藥由植物在脅迫環(huán)境中不斷進(jìn)化所產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)組成，可用于防御病原微生物[6]。其中，揮發(fā)性有機(jī)化合物的釋放自1980年以來(lái)一直受到關(guān)注[7]。植物揮發(fā)油是植物次生代謝中有氣味、易揮發(fā)的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)藥、食品調(diào)味保鮮劑、香料工業(yè)和農(nóng)業(yè)[8]。揮發(fā)油從天然植物和香料中提取出來(lái)，以其良好的抗菌和抗氧化性能而聞名，也因其揮發(fā)性而不會(huì)產(chǎn)生任何殘留效應(yīng)而引起關(guān)注[9]。本研究就揮發(fā)油的植物資源、抗菌活性、活性成分、可能的抗微生物機(jī)制及其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用作一綜述。

1 植物資源

大多數(shù)揮發(fā)油廣泛存在于各種芳香植物中。到目前為止，已經(jīng)確認(rèn)了近3000種揮發(fā)油，其中300種具有重要商業(yè)價(jià)值，特別是在制藥、農(nóng)藝、食品、衛(wèi)生、化妝品和香水行業(yè)[10]。我國(guó)約有56科136屬300種芳香植物，主要分布于溫帶至中溫帶，特別分布于菊科、柳科、烏梅科、唇形科、姜科、樟科、木蘭科、馬兜鈴科、馬鞭科、禾本科、纈草科等科中[11]。揮發(fā)油可以由所有植物器官，即芽、花、葉、莖、枝、種子、果實(shí)、根、木材或樹(shù)皮合成，并儲(chǔ)存在分泌細(xì)胞、表皮細(xì)胞或腺毛等植物組織中。揮發(fā)油含量在植物中一般小于1%，少數(shù)在10%以上。其含量隨植物種類、植物器官或生長(zhǎng)階段的不同而變化。由于分析方法和設(shè)備的限制，多數(shù)研究對(duì)植物揮發(fā)油的化學(xué)成分只進(jìn)行了鑒定。隨著毛細(xì)管氣相色譜的應(yīng)用和完善，可以識(shí)別出數(shù)十種甚至數(shù)百種化學(xué)物質(zhì)，這將有利于香料資源的深入開(kāi)發(fā)和尋找，也有利于優(yōu)良芳香植物品種的選育。從植物中提取揮發(fā)油的方法有多種，目前主要采用沸水或水蒸汽蒸餾法、冷壓萃取法、液體二氧化碳法或微波法[10]。采用水蒸氣蒸餾法和超臨界流體萃取法，揮發(fā)油的提取率和純度均高于其他方法。

2 揮發(fā)油抗菌活性及其主要活性成分

揮發(fā)油的抗菌價(jià)值在于其所具有的生物活性成分及其對(duì)病原菌的特殊作用機(jī)制。對(duì)各種揮發(fā)油的化學(xué)成分初步定性研究表明，其存在醇、醛、酮和酚類等化合物[11]，含量可能因季節(jié)或存在部位而異[12]。這些揮發(fā)性化合物被認(rèn)為是“綠色農(nóng)藥”概念的一部分，是有利于環(huán)境保護(hù)的天然抗菌物質(zhì)[13]。據(jù)報(bào)道，揮發(fā)油的抑菌活性成分一般由1，8-桉葉酚、香茅醛、香茅醇、乙酸香茅酯、檸檬烯、芳樟醇、β-蒎烯、γ-松油烯、α-松油醇和芳香烴等組分組成。芳香植物中的主要生物活性成分被認(rèn)為是次生代謝物的組合[14]。多種揮發(fā)油都具有抗氧化、抗真菌、抗毒素等活性，可用于抑制農(nóng)產(chǎn)品變質(zhì)所涉及的病原菌，并可作為合成化學(xué)品的生態(tài)替代物，用于治療多種細(xì)菌和真菌病害。此外，揮發(fā)油也被認(rèn)為是一種有效的消除玉米烯酮(1種鐮刀菌毒素)污染和/或解毒的手段[13]。

筆者就具有農(nóng)用抑菌活性的揮發(fā)油且研究較為集中的8個(gè)科(姜科、樟科、傘形科、菊科、唇形科、蕓香科、禾本科和馬鞭草科)以及對(duì)病原菌有較強(qiáng)抑菌活性的主要活性成分進(jìn)行分類總結(jié)。

萜烯類是精油的主要成分。萜烯類化合物來(lái)源于許多異戊二烯單元(C5H8)，其連接在一個(gè)鏈中，該鏈可能是環(huán)狀的，也可能不是環(huán)狀的[15]。根據(jù)分子中異戊二烯基的數(shù)量，萜烯可分為單萜烯類、倍半萜烯或二萜衍生物。單萜烯類由2個(gè)異戊二烯單元組成，如檸檬烯、沒(méi)藥烯、α-蒎烯和β-蒎烯，它們主要存在于柑橘、姜花、錫蘭肉桂、香樟、月桂、芫荽中(見(jiàn)表1)。倍半萜烯由3個(gè)異戊二烯單元組成。β-石竹烯是1種天然的雙環(huán)倍半萜，是許多精油的主要成分，特別是在丁香、肉桂、黃花蒿、勝紅薊、百里香的精油中(見(jiàn)表1)。本團(tuán)隊(duì)前期研究以及已發(fā)表文獻(xiàn)表明，佛手揮發(fā)油、D-檸檬烯和γ-松油烯對(duì)三七的3種病原菌(尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和毀壞柱孢霉)均有效，最低抑菌濃度(MIC)為0.12～12.05 mg·mL-1[16]。其中，D-檸檬烯和γ-松油烯抗菌活性均強(qiáng)于完整精油。黃花蒿揮發(fā)油的主成分β-石竹烯，崁烯對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌抗菌活性強(qiáng)于完整精油[17]。

萜類化合物是一大類天然存在的化合物，在精油中是從異戊二烯單位衍生出來(lái)的。但與萜烯不同，萜類化合物中的異戊二烯單元是以許多方式組裝和修飾的，例如添加或除去甲基或在異戊二烯單元中加入氧原子[18]。類似地，萜類化合物可以根據(jù)異戊二烯單位的數(shù)量分為單萜類、倍半萜類或二萜類，也可以根據(jù)其所包含的循環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)量進(jìn)行分類。萜類化合物是一大類抗菌成分，對(duì)微生物具有廣譜活性。常見(jiàn)的抗菌萜類化合物有1，8-丁烯醚、芳樟醇、樟腦、乙酸香葉酯、香葉醇、神經(jīng)醇、萜烯-4-醇和肉桂醛(見(jiàn)表1)。萜類化合物比萜烯類化合物具有更高的抗菌活性，如黃花蒿精油及其萜類成分對(duì)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌抑菌活性均高于佛手揮發(fā)油中的萜烯類化合物[16-17]。大多數(shù)萜類化合物的抗菌活性與其官能團(tuán)有關(guān)[19]。

酚類化合物是指一類由羥基直接與芳香環(huán)結(jié)合而成的化合物。酚類包括百里香酚、丁香酚和香芹酚，可在百里香、丁香、肉桂和牛至油中找到 (見(jiàn)表1)。許多研究報(bào)道，含有高含量酚類物質(zhì)的精油具有廣泛的抗菌功效[20]，如丁香酚對(duì)25種不同細(xì)菌的抗菌活性結(jié)果表明，只有1株細(xì)菌活性未被抑制[19]。本團(tuán)隊(duì)研究表明，丁香揮發(fā)油主成分丁香酚對(duì)導(dǎo)致三七根腐病的5種病原真菌(尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、毀壞柱孢霉、腐霉病菌、立枯絲核菌)和2種導(dǎo)致地上部病害的病原真菌(炭疽病菌、灰霉病菌)具有廣譜抑菌活性[21]。其他研究表明，沙丁氏百里香精油的抗菌性能主要與其高含量的香芹酚和百里香酚有關(guān)[22]。同樣，2種化學(xué)型冬凌草精油對(duì)6株革蘭氏陰性菌和3種革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的抑菌活性的研究表明，以香芹酚為主的揮發(fā)油(75%)的抗菌活性最高，而另一種主要成分為4-萜烯醇(25%)的化學(xué)型活性較弱[23]。苯酚的抗菌活性與其羥基有關(guān)，苯環(huán)的存在增強(qiáng)了酚類化合物的抗菌活性。例如，對(duì)傘花烴(p-cymene)有1個(gè)不具有羥基的苯環(huán)，單獨(dú)使用并不是一種有效的抗菌成分[24-25]，抑菌活性差異可能是由于缺乏1個(gè)自由的羥基來(lái)交換質(zhì)子，從而抑制了其改變細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的能力。此外，羥基在酚醛環(huán)上的相對(duì)位置也會(huì)影響抗菌效果。如香芹酚比百里香酚和丁香酚對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌具有更強(qiáng)的抑菌作用[26]。

不同精油的組合或精油的化學(xué)成分組合可以產(chǎn)生4種可能的抗菌效果：協(xié)同作用、加和作用、無(wú)關(guān)作用或拮抗作用[27]。因此，有研究對(duì)精油組合的有效性進(jìn)行評(píng)估，以提高其抗菌效果，降低農(nóng)業(yè)中農(nóng)藥的使用水平。混合精油的協(xié)同或拮抗作用取決于所測(cè)試的精油類型和微生物菌株。筆者前期研究結(jié)果表明，將佛手揮發(fā)油與化學(xué)農(nóng)藥惡霉靈進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)惡霉靈與佛手揮發(fā)油具有較高的協(xié)同效應(yīng)，分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(FICi)較低 (FICi = 0.31～2.00)[16]。當(dāng)公丁香揮發(fā)油與惡霉靈聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)腐霉、灰霉病菌和炭疽菌有協(xié)同作用。母丁香揮發(fā)油與惡霉靈的組合對(duì)鐮刀菌、腐霉菌和灰霉病菌均表現(xiàn)出加和效應(yīng)[21]。因此，目前很難預(yù)測(cè)精油混合物的抗菌效果。精油是由多種化合物組成的復(fù)雜混合物，各成分之間的相互作用可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同或拮抗的抗菌作用?？偟膩?lái)說(shuō)，多項(xiàng)研究得出的結(jié)論是，將精油主成分按比例混合時(shí)，精油的抗菌活性大于所使用主要成分[28-29]，這表明精油中的次要成分由于具有協(xié)同作用，可能對(duì)抗菌活性至關(guān)重要。

表1中列出了常用的具有抗菌性能的精油的主要成分，大多數(shù)具有高抗菌效果的成分是酚類，其次是含氧萜類化合物。精油中的萜烯和其他成分，包括酮和酯類，如香葉烯醋酸牻牛兒酯顯示出較酚類和萜類化合物偏弱的抗菌活性。

表1 不同科屬來(lái)源代表性植物抑菌活性

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3 揮發(fā)油可能的抑菌機(jī)制

精油的抑菌機(jī)制主要取決于精油中化學(xué)成分的類型。不同的成分可能通過(guò)不同的機(jī)制運(yùn)作，同時(shí)，由于不同種類的微生物細(xì)胞膜組成不同，如革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌，精油的作用機(jī)制也有差異，因?yàn)榫椭胁煌某煞挚赡苡胁煌幕蚨鄠€(gè)靶點(diǎn)[67-68]。因此，很難預(yù)測(cè)使用精油后微生物的易感程度，以及不同菌株敏感程度不同的原因[69]。研究者將精油的抑菌機(jī)制歸因于它們能夠通過(guò)微生物細(xì)胞外膜和細(xì)胞質(zhì)膜滲透到細(xì)胞內(nèi)部，從而分解細(xì)胞結(jié)構(gòu)[69]。此外，精油的某些化學(xué)成分特別是酚類，可以作為質(zhì)子交換劑而具有獨(dú)特的抑菌機(jī)制，降低細(xì)胞質(zhì)膜的pH梯度，特別是當(dāng)被其他成分促進(jìn)時(shí)，由此導(dǎo)致的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力(PMF)的崩潰和三磷酸腺苷(ATP)的耗盡最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[68]。當(dāng)微生物細(xì)胞接觸不同的精油時(shí)，精油的抗菌活性可能涉及細(xì)胞外膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的不同作用。當(dāng)微生物細(xì)胞只接觸到低濃度或亞致死濃度的精油時(shí)，細(xì)胞膜仍能通過(guò)改變脂肪酸飽和程度、碳鏈長(zhǎng)度、支鏈位置、順式/反異構(gòu)化以及不飽和脂肪酸(UFAs)在細(xì)胞膜中轉(zhuǎn)化為環(huán)丙烷來(lái)保持其流動(dòng)性[70-71]。一些研究人員研究了精油成分的分子結(jié)構(gòu)對(duì)其抗菌活性的影響。萜烯類化合物的抗菌機(jī)制發(fā)生在細(xì)胞膜水平，其抗菌活性被歸因于抑制呼吸和其他能量依賴過(guò)程的能力[72]。然而，萜烯類化合物作為單一成分的整體抗菌活性是無(wú)效[67]。

揮發(fā)油是一種非常復(fù)雜的天然混合物，由于多種成分共同起效，其似乎沒(méi)有特定的細(xì)胞靶點(diǎn)[73]。目前，對(duì)揮發(fā)油機(jī)理的研究較少，所取得的成果有限。提出的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：1)影響細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的正常功能。揮發(fā)油作為一種典型的親脂性物質(zhì)，可通過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜，破壞其不同層的多糖、脂肪酸和磷脂的結(jié)構(gòu)，并使其滲透。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)大分子的滲漏和裂解[74]。通過(guò)掃描和透射電鏡觀察到腫脹、皺縮、空泡、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)的滲漏[75]。2)改變能量代謝和還原酶系統(tǒng)。由于揮發(fā)油作用下細(xì)胞滲透性改變，線粒體和過(guò)氧化物酶體也會(huì)受到影響，可引起線粒體膜和DNA的損傷。揮發(fā)油通過(guò)降低膜電位和影響Ca2+循環(huán)，誘導(dǎo)線粒體膜去極化[76]。其他離子通道、質(zhì)子泵和ATP庫(kù)也受到影響。膜的流動(dòng)性會(huì)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激和生物能量失效。然而，從揮發(fā)油衍生出的各種生物活性組分的大多數(shù)可能的作用模式都是間接證據(jù)，缺乏系統(tǒng)的基于驗(yàn)證的研究。由于揮發(fā)油是許多分子的復(fù)雜混合物，從這個(gè)意義上講，為了生物學(xué)的目的，研究揮發(fā)油比研究其某些成分更能提供更多的信息，因?yàn)閰f(xié)同作用的概念似乎更有意義。因此，有必要進(jìn)行深入、全面地實(shí)驗(yàn)室研究，以確定芳香植物的有效抗菌方式。

4 揮發(fā)油系列農(nóng)藥或肥料產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)所面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

“中醫(yī)農(nóng)業(yè)”就是將中醫(yī)原理和方法應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與傳統(tǒng)中醫(yī)的跨界融合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、集成創(chuàng)新。有農(nóng)用活性的植物資源雖然在早期就被篩選出來(lái)，但受到植物自然資源的限制、國(guó)民經(jīng)濟(jì)現(xiàn)狀和使用者認(rèn)知水平的影響，到目前為止，工業(yè)化生產(chǎn)中的植物農(nóng)藥品種仍然很少。植物揮發(fā)油來(lái)源于自然界，具有良好的環(huán)境相容性，是開(kāi)發(fā)無(wú)公害農(nóng)藥的重要資源。目前，植物揮發(fā)油在農(nóng)業(yè)抑菌中的應(yīng)用十分有限，主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。對(duì)這類植物而言，對(duì)揮發(fā)油的農(nóng)業(yè)抑菌活性的研究將擴(kuò)大揮發(fā)油資源在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。前期筆者開(kāi)展了大量揮發(fā)油的活體實(shí)驗(yàn)，例如，佛手揮發(fā)油在連作土壤中對(duì)三七進(jìn)行了進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)與不加揮發(fā)油的三七相比，其發(fā)病率和病情嚴(yán)重程度都有所降低[10]。在公丁香精油噴灑在三七葉片試驗(yàn)中，公丁香精油與惡霉靈聯(lián)用的防治效果達(dá)60.77%[21]。黃花蒿石油醚提取物(主要成分與揮發(fā)油組成相似)在很大程度上抑制了三七根腐病的發(fā)生[17]。生姜揮發(fā)油可以顯著抑制三七根腐病害發(fā)生率且不影響三七植株的生物量積累[30]。

植物揮發(fā)油的化學(xué)成分復(fù)雜多樣，但抑菌化合物可能只是其中的一種或多種。這些物質(zhì)之間也可能存在復(fù)雜的拮抗或協(xié)同效應(yīng)，這意味著揮發(fā)油中的活性化合物需要分離和鑒定，以便為開(kāi)發(fā)新的農(nóng)藥提供必要的資源。精油的化學(xué)分子組成對(duì)其抗菌效果起著重要的作用。精油的抑菌活性涉及微生物細(xì)胞中的幾個(gè)靶點(diǎn)，其中最重要的是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜通常具有滲透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞成分的泄漏。微乳、納米乳液、脂質(zhì)體和生物膜等給藥系統(tǒng)已被用于提高精油的抗菌效果和利用。今后的研究需要側(cè)重于：1)發(fā)現(xiàn)和確定更多的抗菌精油；2)評(píng)價(jià)不同精油的有效性以及與不同化學(xué)農(nóng)藥組合的協(xié)同效應(yīng)；3)從分子水平上了解精油的抗菌機(jī)制，如蛋白質(zhì)合成、核糖核酸(RNA)合成、脫氧核糖核酸(DNA)合成和中間代謝；4)開(kāi)發(fā)有效的傳遞系統(tǒng)，將精油與其他化學(xué)農(nóng)藥或生物殺菌劑一起封裝，以實(shí)現(xiàn)一種協(xié)同替代辦法，最大限度地減少化學(xué)農(nóng)藥使用的負(fù)面影響，有助于改進(jìn)、綜合和可持續(xù)的病害管理。因此，揮發(fā)油具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景，有可能成為發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)、降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和出口農(nóng)業(yè)創(chuàng)匯的有力武器。