鄧雅文，陳恒文，武慶娟，李軍

中國中醫(yī)科學院 廣安門醫(yī)院 心血管科，北京 100053

心律失常(cardiac arrhythmia)是心血管疾病中重要的一組疾病，多因心臟活動的起源和(或)傳導障礙導致心臟搏動的頻率和(或)節(jié)律異常而誘發(fā)，主要表現(xiàn)為心悸、氣短、頭暈乏力等癥狀，還可引起冠狀動脈、腦動脈和腎動脈供血不足[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球發(fā)生心源性猝死的人數(shù)超過700萬，約占總死亡人數(shù)的25%[2]。在我國，心律失常的患者已超過2千萬[3]，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。目前心律失常的西醫(yī)治療仍以藥物治療為主，體外電復律和電除顫及射頻消融術等非藥物療法的不斷發(fā)展給患者帶來更多治療選擇，同時也帶來了藥物不良反應和術后并發(fā)癥等諸多問題；而傳統(tǒng)的中醫(yī)藥注重“整體觀”和“辨證施治”，具有不良反應較小，患者依從性相對較高等特點，對心律失常的患者的療效越來越受到重視，特別是以甘松為主的抗心律失常的中藥及其復方(參松養(yǎng)心膠囊和穩(wěn)心顆粒等)在臨床上廣泛使用，取得了較為滿意的臨床效果。

甘松為敗醬科植物甘松和匙葉甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根莖及根，主產(chǎn)于我國四川、云南和西藏等地。其味辛、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)；具有理氣止痛、開郁醒脾、外用祛濕消腫等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明,甘松有抗癲癇、抗驚厥、抗抑郁、抗瘧、抑菌、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗焦慮、改善血糖代謝等作用[4]。甘松主要成分包括萜類、黃酮類及酚類等[5]。一般認為當歸素(angelicin)、甘松新酮(nardosinone)、甘松香酮A(kanshone A)和甘松香酮B(kanshone B)、甘松新酮二醇等為其主要有效活性成分[6-8]。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學學科基礎，結合現(xiàn)有的藥理學基礎，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設計的一門新學科[9-10]。網(wǎng)絡藥理學不僅能揭示更復雜的藥理學規(guī)律，更是從整體的角度對藥物與疾病間的奧秘進行了探索。從系統(tǒng)性、整體性的方法學特點來說，網(wǎng)絡藥理學與中醫(yī)藥“整體觀念”“辨證論治”的哲學思想不謀而合。本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法，預測并篩選甘松干預心律失常的重要成分及其作用靶點，探討甘松對心律失?？赡艿母深A機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[11](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、ETCM數(shù)據(jù)庫[12](http：//www.nrc. ac.cn：9090/ETCM/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫[13](http：//tcmspw.com/)收集甘松化學成分；TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)收集心律失常疾病相關靶點；重要成分對應靶點用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行預測；Venny在線網(wǎng)絡獲得成分交集及靶點交集；STRING version 11.0數(shù)據(jù)庫構建作用靶點與相關蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析；FunRich version 3.13軟件進行甘松基因靶點富集網(wǎng)絡數(shù)據(jù)分析；靶點通路富集注釋網(wǎng)絡用KEGG在線平臺分析并繪制。利用Cytoscape version 3.7.2軟件構建成分靶點可視化網(wǎng)絡。

1.2 甘松的化學成分收集及重要成分篩選

通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫和TCMSP數(shù)據(jù)庫，基于不同的計算機算法對中藥“甘松”進行檢索，收集甘松化學成分，將結果進行匯總。將篩選得到3個數(shù)據(jù)庫共有的甘松化學成分作為其重要化學成分。

1.3 甘松化學成分靶點篩選

借助BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，基于產(chǎn)物相似、靶點相近、交叉驗證的工作原理對甘松重要成分的靶點進行預測。

1.4 心律失常疾病相關靶點及甘松治療心律失常疾病作用靶點篩選

在TTD數(shù)據(jù)庫、GeneCads數(shù)據(jù)庫中通過檢索關鍵詞“cardiac arrhythmia”獲得心律失常疾病相關靶點；靶點名稱均選擇UniprotKB提供的基因簡稱；將甘松重要成分所對應的預測靶點與心律失常疾病相關靶點進行映射，借助在線韋恩圖直觀讀取并分析得到甘松治療心律失常的作用靶點。

1.5 甘松治療心律失常的重要成分-預測靶點可視化網(wǎng)絡構建

將甘松重要化學成分名稱與其對應的預測靶點通過Microsoft Excel表格進行數(shù)據(jù)編排，分別導入基于JAVA 8.0環(huán)境工作變量的Cytoscape version 3.7.2計算機可視化軟件中，構建甘松重要成分-預測靶點網(wǎng)絡。

1.6 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡構建

將基于公共數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站獲取的甘松治療心律失常的作用靶點上傳到STRING蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫“Multiple proteins”的功能框，選擇人種為“Home sapiens”后獲取PPI網(wǎng)絡。如因靶點太少沒有產(chǎn)生相關連接蛋白，可通過一次或幾次的擴展獲取關聯(lián)蛋白。

1.7 GO富集注釋分析及KEGG通路分析

運用FunRich version 3.1.3軟件工具[14]，對關鍵靶點進行GO富集注釋。該軟件可以加載Gene Ontology數(shù)據(jù)庫，建立甘松的關鍵靶點datasets后，選擇Gene Ontology Functional Term 3組內(nèi)容(生物學過程、細胞組分或分子功能)任一組，從中選擇合適的圖表。將甘松治療心律失常的人源關鍵靶點導入KEGG數(shù)據(jù)庫進行可能的靶點通路富集情況檢索，并繪制甘松治療心律失常的作用機制通路圖。

2 結果

2.1 甘松化學成分

采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索“GAN SONG”，靶點參數(shù)設置為“Score cutoff=20”，獲得63個化合物，其中24個無結構信息，故予以排除，得到39個甘松化學成分。經(jīng)ETCM數(shù)據(jù)庫檢索“甘松”，獲得38個成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索“甘松”獲得57個化學成分。除去重復成分，共得到108個甘松化學成分，見圖1。

圖1 不同數(shù)據(jù)庫獲取甘松化學成分的韋恩圖

2.2 甘松重要成分及對應靶點

從TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中得到9個共有成分，作為甘松的重要成分，見表1。采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對9個重要成分所對應的靶點進行了預測，設置參數(shù)P-value為0.05(默認值)，經(jīng)去重后得到預測靶點198個，見表1。

表1 甘松重要成分信息

續(xù)表1

2.3 心律失常疾病相關靶點及甘松作用靶點

以“cardiac arrhythmia”為關鍵詞分別在Genecards和TTD數(shù)據(jù)庫檢索心律失常相關疾病靶點。獲得GeneCards數(shù)據(jù)庫中心律失常疾病相關靶點13個，TTD數(shù)據(jù)庫中心律失常疾病相關靶點8個，除去重復疾病相關靶點，心律失常疾病相關靶點共19個。將甘松預測靶點與心律失常疾病靶點進行映射，取交集，得到甘松治療心律失常作用靶點4個，分別為ADORA1、KCNQ1、KL、CAT，見圖2。

圖2 甘松預測靶點與疾病靶點共有作用靶點韋恩圖

2.4 甘松治療心律失常重要成分-預測靶點可視化網(wǎng)絡

在Cytoscape version 3.7.2軟件中導入甘松重要成分和預測靶點數(shù)據(jù)表，生成甘松治療心律失常的重要成分-預測靶點可視化網(wǎng)絡，見圖3。根據(jù)疾病靶點-共同靶點-預測靶點數(shù)據(jù)信息，構建相關靶點網(wǎng)絡，見圖4。

2.5 PPI網(wǎng)絡分析

上傳甘松的4個作用靶點到STRING在線蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中，發(fā)現(xiàn)作用靶點較少，無法生成相關蛋白質(zhì)之間連接，需要擴展靶點。通過2次擴展后，得到除4個作用靶點之外的10個關聯(lián)靶蛋白，分別是GSR、SOD1、SOD2、SOD3、GNAI2、KCNE3、KCNE2、KCNE1、AKAP9、FGF23。因此，共14個靶蛋白作為關鍵靶蛋白，見圖5。

2.6 GO富集分析

通過PPI分析擴展得到的14個關鍵靶蛋白，加載到FunRich軟件中Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行GO Term富集分析。其中，生物學過程條目(biological process)160條，分子功能(molecular function)條目26條，細胞組分(cellular component)條目26條。在生物學過程方面中，根據(jù)P<0.001選擇顯著性富集條目有：心室肌細胞膜復極的調(diào)節(jié)(regulation of ventricular cardiac muscle cell membrane repolarization)、膜復極參與動作電位的調(diào)節(jié)(membrane repolarization during ventricular cardiac muscle cell action potential)、心肌收縮的調(diào)節(jié)(regulation of cardiac muscle contraction)、心室心肌細胞動作電位的膜復極(GO：0098915)、鉀離子跨膜外輸(GO：0097623)等，見圖6。

在分子功能方面中，根據(jù)P<0.001篩選最顯著富集的條目有5條，包括電壓門控鉀通道活性與心室肌細胞動作電位復極化(GO：1902282)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity)、延遲整流鉀通道活性(delayed rectifier potassium channel activity)、鉀通道調(diào)節(jié)活動(potassium channel regulator activity)和離子通道結合(ion channel binding)，見圖7。在細胞組分方面，以P<0.001篩選顯著性條目只有電壓門控鉀通道復合體(voltage-gated potassium channel complex)條目，見圖8。

注：菱形代表重要成分；三角形代表對應的預測靶點；紅色菱形代表含有對應靶點的重要成分；淡綠色菱形代表沒有對應靶點的重要成分；深灰色三角形代表預測靶點。圖3 甘松重要成分與預測靶點的可視化網(wǎng)絡

注：淺藍色圓形代表靶點；數(shù)字1所連接的區(qū)域代表疾病靶點；數(shù)字2連接的區(qū)域代表共同靶點；數(shù)字3連接的區(qū)域代表預測的靶點。圖4 疾病靶點-共同作用靶點-預測靶點網(wǎng)絡

注：節(jié)點代表靶蛋白；邊代表功能相關性；藍色線條代表共存證據(jù)；紫色線條代表有實驗證據(jù)；黃色線條代表文本挖掘；黑色線條代表共表達的數(shù)據(jù)。圖5 甘松治療心律失常作用PPI網(wǎng)絡

圖7 甘松治療心律失常的分子功能富集分析

圖8 甘松治療心律失常的細胞組分富集分析

2.7 甘松治療心律失常的關鍵靶蛋白KEGG通路分析

依據(jù)靶點富集在通路的個數(shù)和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)確定甘松治療心律失常可能的KEGG通路有17條，主要涉及過氧化酶(peroxisome)、長壽相關通路(longevity regulating pathway)、心肌細胞腎素能信號(adrenergic signaling in cardiomyocytes)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等(見表2)。選擇其中過氧化酶、心肌細胞腎素能信號通路進行繪制，見圖9～10。

表2 甘松治療心律失常的關鍵靶點KEGG分析(17條)

續(xù)表2

注：白色節(jié)點代表信號通路蛋白；紅色代表甘松的關鍵靶點蛋白。圖9 甘松治療心律失常的主要通路——過氧化酶

注：白色節(jié)點代表通路蛋白；紅色代表甘松的關鍵作用靶蛋白；實線箭頭代表直接關系；虛線箭頭代表間接關系。圖10 甘松治療心律失常的主要通路——心肌細胞腎素能信號通路

3 討論

甘松始載于唐代《本草拾遺》，從1963年正式收入《中華人民共和國藥典》，具有芳香開竅、行氣解郁的功效。據(jù)《本草綱目》記載，甘松“甘，溫，無毒，主治惡氣、卒心腹痛滿、下氣”，說明甘松能解久病之郁滯，能入心經(jīng)，具有安心、養(yǎng)血和定悸的功效。甘松藥性溫而不燥，味甘，具有開郁醒脾、理氣止痛之功，還能調(diào)節(jié)脾胃升降之機，具有補而不滯的功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，甘松具有抗焦慮、抗心律失常、抗抑郁、抗氧化、改善心肌缺血、調(diào)節(jié)血壓、改善血糖代謝及減少消化性潰瘍面積等諸多功效。臨床應用中，甘松常被用于治療心血管疾病和消化系統(tǒng)疾病。市場上常見的穩(wěn)心顆粒、參松養(yǎng)心膠囊，其中的主要組分就包含甘松。目前從甘松中分離提取的化合物按化學結構可大致分為萜類、黃酮類、香豆素和木脂素類、揮發(fā)油、糖類、無機元素及其他類[14]，其中以萜類化合物含量較高，具有較好的藥用價值。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版[4]對甘松的記載，甘松新酮是甘松干燥品的最具代表性成分。甘松化學成分復雜，目前其抗心律失常的作用機制尚不清楚。因此，通過網(wǎng)絡藥理學技術初步研究甘松抗心律失常的作用機制具有重要意義。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法檢索甘松的化學成分，并對核心交集成分進行靶點預測，將作用靶點經(jīng)蛋白互作擴展后得到的關鍵靶蛋白進行GO分析和KEGG通路分析，并對甘松抗心律失常的靶點機制進行網(wǎng)絡構建與分析。本研究檢索得到甘松的9個重要成分，對重要成分的對應靶點進行預測，去除成分中相同的靶點后得到198個預測靶點。將預測靶點映射心律失常疾病靶點，得到甘松抗心律失常的作用靶點是ADORA1、KCNQ1、KL和CAT。對甘松抗心律失常作用靶點進行PPI分析，通過擴展靶點共得到14個關鍵靶點蛋白，并進行GO-Term富集分析。甘松抗心律失常作用在生物學過程方面，與心室肌細胞膜復極的調(diào)節(jié)、心室肌細胞動作電位中的膜復極、延遲整流鉀通道活性、鉀離子跨膜外輸顯著相關；分子功能方面與電壓門控鉀通道活性與心室肌細胞動作電位復極的關系、超氧化物歧化酶活性、延遲整流鉀通道活性、鉀通道調(diào)節(jié)活性功能顯著相關；細胞組分方面與電壓門控鉀通道復合體顯著相關。通過KEGG分析得到甘松預測靶點的17條通路，涉及了過氧化酶、長壽通路、心肌細胞的腎上腺素信號通路、調(diào)節(jié)脂肪細胞的脂解作用信號通路、胃酸分泌、Foxo信號通路、cGMP-PKG信號通路、Rap1信號通路、cAMP信號通路等。

基因表型及基因突變在遺傳性心律失常疾病中具有十分重要的意義。已知研究顯示，ADORA1又名腺苷A1受體，是G-蛋白偶聯(lián)受體。A1受體激活抑制腺苷環(huán)化酶，降低細胞內(nèi)cAMP的濃度，誘導鉀離子通道的開放，從而間接降低鈣離子進入細胞的滲透能力。腺苷能減慢竇性心律，尤其是房室傳導，有減慢心率的作用(A1作用)，可用于治療室上性心動過速。其作用是誘導鉀離子通道的開放，允許鉀離子流出，從而增加細胞極化，并能降低缺血再灌注后造成的心肌損傷。由KCNQ1蛋白組成的通道主要存在于內(nèi)耳和心肌中。在心臟組織中，這些通道在每次心跳后都參與心肌充電，使其保持有規(guī)律的節(jié)奏。KCNQ1基因突變與長QT綜合征關系密切，有研究[15]發(fā)現(xiàn)KCNQ1基因突變易導致輕度I通道功能障礙，攜帶KCNQ1基因突變的患者發(fā)生嚴重心律失常和猝死的風險較一般正常人高。基于此，甘松的靶點預測對相關新藥開發(fā)有一定的參考價值。目前僅有文獻報道甘松抗心律失?？赡芘c環(huán)磷酸腺苷(cAMP)有關，但其他通路還待進一步發(fā)現(xiàn)和實驗確證。cAMP是一種環(huán)狀核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，使cAMP底物蛋白磷酸化，從而加速對鈣的攝取和轉運。該信號通路作為重要的細胞內(nèi)轉導通路，是通過腺苷酸環(huán)化酶活性的變化來調(diào)節(jié)靶細胞內(nèi)第二信使cAMP的水平，進而影響細胞代謝行為等下游事件[16-17]。簡鵬等[18]通過對大鼠腹腔內(nèi)注射甘松主要活性成分甘松新酮，選用激光共聚焦顯微鏡測量心肌細胞鈣離子變化，用凝膠成像法檢測cAMP及PKA的變化，發(fā)現(xiàn)甘松新酮能明顯抑制心肌細胞鈣離子超載，促進心功能恢復，預測甘松新酮可能是通過影響cAMP-PKA細胞信號轉導通路來起作用的。

綜上，本研究預測的靶點與已知文獻報道的甘松治療心律失常的作用基本吻合，體現(xiàn)了靶點預測的準確性，同時揭示了甘松多成分、多靶點、多途徑作用的特點。目前有關甘松作用靶點、抗心律失常機制層面的研究報道較少，還需后續(xù)更多實驗的驗證。通過網(wǎng)絡藥理學分析可為今后深入研究甘松干預心律失常的分子機制提供一定的參考。