邱志偉 梅陽陽 仲衛(wèi)紅 付長龍 謝新宇 牛曉敏 葉銀燕

【摘 要】目的：利用生物信息學(xué)方法分析腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-17A（IL-17A）對骨關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細胞的作用機制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE93720基因芯片數(shù)據(jù)集，利用GEO2R篩選出差異表達基因。用DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO分析和KEGG信號通路分析，String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)間相互網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化編輯，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，然后用MCODE插件進行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析。結(jié)果：共篩選出差異表達基因256個，其中上調(diào)基因213個，下調(diào)基因43個。差異最顯著的5個基因是C15orf48、CXCL8、CCL20、CXCL3、CXCR4。上調(diào)的差異基因GO分析主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞因子活性、趨化因子活性等。上調(diào)的差異基因KEGG信號通路分析主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路等。結(jié)論：利用生物信息學(xué)方法分析TNF-α和IL-17A誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的基因表達譜變化，為探究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制提供指導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;腫瘤壞死因子-α;白細胞介素-17A;成纖維樣滑膜細胞;生物信息學(xué)

【ABSTRACT】Objective：To analyze the mechanism of TNF-α and IL-17A on fibroblast-like synoviocytes in patients with osteoarthritis by bioinformatics.Methods：Microarray data set GSE93720 was downloaded from the GEO database and deferentially expressed genes were screened by GEO2R.Go analysis and KEGG signal pathway analysis of deferentially expressed genes were carried out using the online database David 6.8.The inter protein network was constructed by String database.The core genes in the network were screened out by using the software of Cytoscape 3.7.1.Then the sub network module was analyzed by plug-in MCODE.Results：A total of 256 differentially expressed genes were screened，including 213 up-regulated genes and 43 down-regulated genes.The five genes with the most significant difference were C15orf48，CXCL8，CCL20，CXCL3 and CXCR4.The GO analysis for the up-regulated differential genes mainly involved immune response，inflammatory response，signal transduction，cytokine activity and chemokine activity.The KEGG signaling pathway analysis for the up-regulated differential genes mainly involves cytokine-cytokine receptor interaction，tumor necrosis factor signaling pathway and chemokine signaling pathway.Conclusion：The analysis of the gene expression profile of fibroblast-like synoviocytes in osteoarthritis induced by TNF-α and IL-17A by bioinformatics method can provide guidance for exploring the pathogenesis of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;TNF-α;IL-17A;fibroblast-like synoviocytes;bioin-formatics

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床上最常見的關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為疼痛、關(guān)節(jié)軟骨退變、結(jié)構(gòu)變化，以及功能下降。本病受體質(zhì)量、外傷、年齡、性別、基因、環(huán)境等多種因素影響[1-2]，60歲以上人群患病率為24%，其中女性是男性的3倍[3]。OA難以徹底治愈且易反復(fù)，對患者造成很大的困擾。以往的研究發(fā)現(xiàn)，滑膜在OA中發(fā)揮著重要的作用[4]，在OA發(fā)病過程中，滑膜細胞大量增生，滑膜顯著增厚。滑膜細胞分為A、B兩型，A型包括巨噬細胞樣具有吞噬功能的細胞;B型如成纖維樣滑膜細胞（FLS），主要功能是分泌透明質(zhì)酸，為關(guān)節(jié)提供潤滑和營養(yǎng)作用。此外，F(xiàn)LS還可產(chǎn)生多種生長因子、趨化因子以及細胞因子如核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體（RANKL），促進破骨細胞形成和軟骨破壞，參與OA的發(fā)病機制[5-6]。

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是造成關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的重要因子，可誘發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素進而影響軟骨的破壞，也可通過調(diào)節(jié)FLS的神經(jīng)生長因子影響OA患者的關(guān)節(jié)疼痛，因此，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的治療中[7-8]。白細胞介素-17（IL-17）是介導(dǎo)OA的一種重要炎性因子，阻斷IL-17信號通路可有效緩解疼痛[9]。IL-17家族可分為6個亞型，IL-17A在其中占主導(dǎo)作用[10]。IL-17介導(dǎo)的炎癥可導(dǎo)致FLS線粒體功能障礙，進而刺激炎性淋巴細胞浸潤[11]。TNF-α和IL-17A在OA的發(fā)展過程中均扮演重要角色，且相關(guān)研究證明這兩者之間有協(xié)同作用。例如，IL-17A和TNF-α可通過對成骨基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、Wnt5a和Runx2的影響，誘導(dǎo)FLS向成骨細胞分化[12]。FISCHER等[13]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合阻斷IL-17A和TNF-α對于抑制細胞因子、趨化因子以及阻止OA的發(fā)展更有效。本研究通過選取經(jīng)過TNF-α和IL-17A聯(lián)合處理的OA患者FLS芯片，利用生物信息學(xué)方法分析該基因表達譜數(shù)據(jù)，探究TNF-α和IL-17A聯(lián)合作用于OA患者FLS作用的分子機制，為未來OA的臨床治療提供方向和證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 GEO基因芯片數(shù)據(jù)的獲取 GEO是一個龐大的公共基因數(shù)據(jù)集存儲庫，儲存著眾多的基因數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的原始系列和來源平臺[14]。從該數(shù)據(jù)庫中下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE93720，該數(shù)據(jù)集基于Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺，包括2例OA和2例RA患者的FLS，取自美國Brigham and Womens Hospital滑膜切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)后丟棄的組織中分離出的FLS，共有48個樣本（包括未經(jīng)處理、TNF-α單獨處理，以及TNF-α和IL-17A共同處理的樣本），為了分析TNF-α和IL-17A聯(lián)合作用對OA發(fā)生發(fā)展的影響，取6個OA-FLS未經(jīng)處理樣本作為對照組，6個TNF-α和IL-17A共同處理的樣本作為實驗組。該樣本第1天在含體積分數(shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中，以每孔50 000個細胞的速度培養(yǎng)。第2天用含體積分數(shù)為1%的胎牛血清的培養(yǎng)基進行血清饑餓。第3天對照組不受刺激，實驗組TNF-α（1 ng·mL-1） + IL-17A（1 ng·mL-1）刺激約20 h，之后用TRizol試劑（Life Technologies）收集樣本。該芯片的平臺文件為GPL570。

1.2 差異基因的篩選 基因表達分析工具GEO2R是基于R語言應(yīng)用t檢驗或者方差分析尋找差異表達基因（DEGs）的軟件，利用GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）對2組FLS基因進行差異分析，篩選出DEGs，并且設(shè)置篩選范圍為P < 0.05，差異倍數(shù)|log2FC| ≥ 2。

1.3 功能富集分析 注釋分析工具DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov）在線數(shù)據(jù)庫對DEGs進行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析，GO分析包括生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能。富集分析過程中，校正P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 基于STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.7.1軟件獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 通過GEO2R對GSE93720進行篩選，首先去除沒有Gene Symbol注釋的條目，并設(shè)置篩選范圍為P < 0.05，差異倍數(shù)|log2FC|≥2。

篩選后，由于探針和基因可能出現(xiàn)一對多與多對一的關(guān)系，當一個探針對應(yīng)多個基因時，說明探針不能特異定位到某個基因上，不能說明是某個特定基因的表達量，因此刪除;當多個探針對應(yīng)一個基因時，取這些探針的均值作為基因的最終表達值。同樣，在GEO數(shù)據(jù)庫中下載矩陣文件，將探針名轉(zhuǎn)化為基因名，取重復(fù)基因探針的均值，為繪制聚類分析熱圖做準備。共篩選出差異表達基因256個，其中上調(diào)基因213個，下調(diào)基因43個。上調(diào)的DEGs中，差異最顯著的5個基因有C15orf48、CXCL8、CCL20、CXCL3、CXCR4。利用R語言對DEGs構(gòu)建火山圖和熱圖，如圖1、圖2。

2.2 DEGs的GO分析和KEGG通路分析 取上調(diào)基因進行GO分析和KEGG通路分析，選取最顯著的前5個，包括生物學(xué)過程：免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對病毒的防御反應(yīng)。細胞組分：細胞質(zhì)、等離子體膜、細胞外空間、胞質(zhì)溶膠、細胞外區(qū)域。分子功能：蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、細胞因子活性、受體結(jié)合、趨化因子活性。見表1。上調(diào)差異基因的KEGG通路分析主要集中在細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF信號通路、甲型流感、趨化因子信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等。見表2。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè) 將篩選出的256個差異基因上傳到STRING在線數(shù)據(jù)庫中，得到差異基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，將該PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1中進行可視化，網(wǎng)絡(luò)共有204個節(jié)點和1613條邊，見圖3。用cytoHubba 插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)中每個節(jié)點的度值（degree），選取度值最高的5個當作核心基因，分別是IL-6、CXCL10、IL-1β、CCL8和TLR2，關(guān)系網(wǎng)見圖4。MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行子模塊分析，模塊得分最高的有2個，見圖5。分別是模塊一30.3分，32個節(jié)點，470條邊。模塊二19.5分，22個節(jié)點，205條邊。2個模塊的基因均為上調(diào)基因。

3 討 論

在OA發(fā)病過程中滑膜產(chǎn)生炎癥且繼發(fā)增生，F(xiàn)LS作為滑膜的主要組成部分，大量存在于增生的滑膜組織中，加速關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)軟骨的破壞，與OA的發(fā)展緊密相關(guān)。以往的研究表明，IL-17A與TNF-α皆可促進滑膜炎癥的發(fā)展，且兩者有協(xié)同作用。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出GSE93720基因芯片，利用生物信息學(xué)方法把OA患者FLS經(jīng)過TNF-α和IL-17A處理與未經(jīng)處理的細胞進行對比，篩選出差異基因256個，包括上調(diào)的213個和下調(diào)的43個。上調(diào)的DEGs中，差異最顯著的5個基因有C15orf48、CXCL8、CCL20、CXCL3、CXCR4。有研究表明，CXCL8對OA患者軟骨細胞具有促炎作用;CXCL8可通過增強其他炎性因子的表達，促進細胞的凋亡，加重OA進程[15]。GUAN等[16]發(fā)現(xiàn)，CCL20在OA患者滑膜液中的水平與K-L分級呈顯著相關(guān);且CCL20可通過CCR6激活關(guān)鍵的信號通路，促進FLS中促炎性介質(zhì)的合成，可將抗CCL20作為OA藥物治療研究的潛在目標[17]。CXCL3作為強中性粒細胞趨化因子，在OA中表達增加[18]，F(xiàn)LS產(chǎn)生大量的趨化因子（包括CXCL8和CXCL3），參與了滑膜組織炎癥細胞的浸潤[19]。CXCR4參與了基質(zhì)細胞衍生因子誘導(dǎo)的OA-FLS中IL-6的表達[20]，且基質(zhì)細胞衍生因子與CXCR4相互作用會導(dǎo)致軟骨變性，進一步加重關(guān)節(jié)損傷[21]。說明TNF-α和IL-17A作為OA發(fā)展過程中重要的促炎因子，主要通過激活趨化因子促進FLS中炎性介質(zhì)的合成，進一步導(dǎo)致軟骨的變性以及關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。

GO分析顯示，F(xiàn)LS相關(guān)基因除了與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)外，還可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)識別周圍環(huán)境的各種信號，進而改變細胞內(nèi)的分子活性以及細胞的某些代謝過程，甚至影響細胞的生長與凋亡。分子功能包括蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、細胞因子活性和趨化因子活性等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)差異基因主要參與了細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF-α信號通路、趨化因子信號通路等。CAI等[22]通過對比OA和RA患者FLS的差異基因，發(fā)現(xiàn)OA和RA的發(fā)展中均有TNF-α信號通路和趨化因子通路的參與，且TNF-α信號通路主要參與OA的發(fā)展，與本研究的結(jié)論相似。說明在IL-17A和TNF-α的影響下，細胞因子之間相互作用，OA-FLS中TNF-α信號通路和趨化因子通路被激活，通過大量趨化因子如CXCL8、CCL20、CXCL3、CXCR4，促使FLS釋放更多炎性因子，加快滑膜炎癥的發(fā)展。

在差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中利用cytoHubba插件得出5個度值最高的核心基因：IL-6、CXCL10、IL-1β、CXCL8和TLR2。已經(jīng)有大量研究表明，IL-6和IL-1β是參與OA軟骨退行性變的重要炎性細胞因子。PEARSON等[23]發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細胞和FLS之間具有交互作用，F(xiàn)LS分泌IL-6是由軟骨細胞來源的IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生的。在OA患者的滑膜液和FLS中IL-6過表達，IL-6濃度與OA的放射學(xué)嚴重程度和基質(zhì)金屬蛋白酶水平相關(guān)[24-25]。IL-1β由滑膜中的巨噬細胞產(chǎn)生，可刺激滑膜細胞降鈣素樣受體的表達，誘導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽信號通路，進而導(dǎo)致OA產(chǎn)生疼痛[26]。IL-1β也可刺激FLS產(chǎn)生外泌體，導(dǎo)致軟骨細胞基因表達模式的改變和軟骨退化[27]。MCGARRY等[28]證明激活Toll樣受體（TLR2）可導(dǎo)致RA-FLS的線粒體功能障礙，影響線粒體呼吸功能與細胞的代謝活動;與IL-17A共同影響線粒體功能，促進炎性細胞的浸潤[11]。RANKL是在FLS上表達的細胞因子，可激活破骨細胞，造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷，TLR2可增加由IL-17介導(dǎo)的RANKL表達，進一步加深關(guān)節(jié)炎癥與軟骨的破壞[6，29]。

綜上所述，TNF-α和IL-17A共同作用于OA患者FLS，主要是通過上調(diào)IL-6、IL-1β等炎性細胞因子以及大量的趨化因子如CXCL8、CCL20、CXCL3、CXCR4加重軟骨退行性變和滑膜炎癥，從而加深OA的病情發(fā)展。未來OA治療可針對TNF-α和IL-17A的抑制，或者阻斷兩者之間的聯(lián)系作為研究方向。但本文尚存在不足之處，例如篩選差異表達基因來源的樣本量較少，且樣本源自于美國OA患者，與國內(nèi)OA患者存在一定的種族差異，今后需要獲取更多的國內(nèi)樣本進行驗證。

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收稿日期：2020-02-28;修回日期：2020-04-15