李曉瑞,王 梓,劉貴珊,*,趙君哲,余江泳,張曉娟,樊奈昀(.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 7500;.撫順獨(dú)鳳軒骨神生物技術(shù)股份有限公司,遼寧撫順 3)

骨素是骨經(jīng)過高溫高壓抽提、脫除油脂和濃縮得到的骨抽提物,其營養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)以及風(fēng)味物質(zhì)等,是生產(chǎn)調(diào)味品的重要基料[1]。牛骨素香精雖口感醇厚、肉味飽滿,但是鮮味不足,生產(chǎn)過程中需要添加呈味核苷酸二鈉來增強(qiáng)牛骨素香精的鮮味,增加生產(chǎn)成本。雞骨素鮮味濃郁,且雞骨原料相較于牛骨原料成本略低,通過兩種骨素復(fù)合可以降低生產(chǎn)成本、達(dá)到改善牛骨素香精的鮮味、減少添加呈味核苷酸二鈉的目的。目前,對牛骨素、雞骨素、豬骨素的滋氣味和加工性能的研究報(bào)道較多,但是對復(fù)合骨素報(bào)道較少[2-6]。

生物酶解技術(shù)是生產(chǎn)天然安全調(diào)味基料的常用方法,其反應(yīng)條件溫和、能耗低、污染少,反應(yīng)進(jìn)程定向、可控,在骨素風(fēng)味形成中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[7]。用于酶解骨素蛋白的蛋白酶主要包括內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。內(nèi)切蛋白酶能識別特有的氨基酸序列,將連接氨基酸的酰胺鍵從酶切位點(diǎn)斷開,得到長短不同的多肽和氨基酸[8]。外切蛋白酶作用于蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵,釋放末端的疏水性氨基酸,但是對于蛋白質(zhì)內(nèi)部肽鍵幾乎沒有作用,因此將外切酶與內(nèi)切酶組合使用可以深度水解蛋白質(zhì),提高酶解液水解度,釋放大量氨基酸和短肽[9]。目前,國內(nèi)外研究主要集中于雞骨素、牛骨素、豬骨素酶解種類的選擇,對復(fù)合骨素酶種類的選擇少有研究。喬凱娜等[10]通過研究紅燒風(fēng)味香精滋味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶組合酶解豬肉,得到的紅燒風(fēng)味香精感官評分更高。董憲兵等[11]通過組合酶酶解雞骨素工藝及風(fēng)味物質(zhì)研究表明,木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的添加方式對雞骨素風(fēng)味物質(zhì)有重要影響。徐欣如等[12]探究了單酶和組合酶對牛骨素?zé)岱磻?yīng)香精滋氣味的影響,發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組合酶解牛骨素效果最佳。Chiang等[13]通過探究美拉德反應(yīng)對牛骨酶解液理化性質(zhì)及風(fēng)味成分的影響,發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶酶解牛骨素可以改善牛骨酶解液風(fēng)味。

本文以牛骨素和雞骨素的復(fù)合骨素為研究對象,采用四種組合蛋白酶(木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶)酶解復(fù)合骨素,通過測定水解度、游離氨基酸、呈味核苷酸、味精當(dāng)量、肽分子量分布等呈味物質(zhì)指標(biāo),探究組合酶種類對四種復(fù)合骨素酶解液呈味物質(zhì)的影響,為復(fù)合骨素酶解深加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清湯型牛骨素、雞骨素 撫順獨(dú)鳳軒骨神生物技術(shù)股份有限公司;復(fù)合蛋白酶(Protamex,47500 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme,25000 U/g)、木瓜蛋白酶(Nematolyt,157000 U/g)、堿性蛋白酶(Alkaline proteinase,302420 U/g)、菠蘿蛋白酶(Bromelain,600000 U/g) 丹麥諾維信公司;葡萄糖 源葉生物科技有限公司;甲醛、氫氧化鈉、磺基水楊酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、三氟乙酸 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,飛賽爾科技(中國)有限公司;混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)、肽標(biāo)準(zhǔn)品(甘氨酸、抑肽酶、細(xì)胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽) 美國Sigma公司。

BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JI-1 精密增力電動攪拌器 國華電器有限公司;TSK-gel ODS-80 TM色譜柱(4.6 mm×250 mm) 美國J&W公司;TSK gel G2000 SWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm) 日本島津公司;1260高效液相色譜儀、AgilentEclipse XDB-C18柱 美國Agilent公司;8900全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合骨素酶解液的制備 取牛骨素(Brix=50%)70 g,雞骨素(Brix=50%)30 g,按1∶1添加蒸餾水稀釋,四種組合酶在pH為6.2的條件下,按表1條件酶解1 h后,90 ℃滅酶10 min,制得四種復(fù)合骨素酶解液,其中E/S為每克蛋白中酶活的添加量。

表1 復(fù)合骨素提取物酶解條件Table 1 Conditions for enzymatic hydrolysis of complex bone extract

1.2.2 水解度測定 氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法進(jìn)行測定[14]。準(zhǔn)確吸取5 mL酶解液至100 mL容量瓶,并添加蒸餾水定容,從中取20 mL稀釋液至燒杯中,加入60 mL蒸餾水混勻,在磁力攪拌狀態(tài)下,用標(biāo)定好的0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH8.2,加入10 mL甲醛溶液后繼續(xù)滴定至pH9.2,記錄消耗的NaOH溶液體積。80 mL蒸餾水在相同條件下進(jìn)行滴定,作為空白溶液。溶液中氨基酸態(tài)氮含量的計(jì)算公式為:

式中:x為溶液中氨基酸態(tài)氮的含量(g/100 g);V1為滴定樣品時，pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V2為滴定空白溶液時,pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V3為參與反應(yīng)的稀釋液體積(mL);C為NaOH溶液濃度(C=0.05 mol/L)。

總蛋白質(zhì)含量通過FOSS全自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定,消化程序?yàn)?00 ℃消化30 min,升溫至420 ℃消化1 h。水解度的計(jì)算公式為:

1.2.3 游離氨基酸含量的測定 參照Chungchunlam等[15]的方法,并稍作修改。取復(fù)合骨素酶解液2 mL、2 mL 40% 磺基水楊酸于10 mL離心管內(nèi),然后在10000 r/min下、4 ℃離心20 min,取上清液于50 mL離心管中,并用超純水定容,過0.22 μm濾膜,待氨基酸分析儀上機(jī)。

氨基酸分析條件[16]:色譜柱為日立專用離子交換樹脂(4.6 mm×60 mm),檢測波長為440 nm;緩沖液流速35 mL/h;柱溫 31～76 ℃;茚三酮溶液流速25 mL/h;進(jìn)樣量20 μL。

1.2.4 核苷酸含量的測定 參照Chen等[17]的方法,并稍作修改。取復(fù)合骨素酶解液1 mL于50 mL離心管內(nèi),加25 mL超純水,然后在10000 r/min下、4 ℃離心20 min,取上清液于50 mL離心管中,并用超純水定容,過0.22 μm濾膜,待HPLC測定。

高效液相色譜條件[18]:色譜柱為TSK-gel ODS-80 TM(4.6 mm×250 mm),柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為254 nm,進(jìn)樣量為10 μL,流速為0.8 mL/min。流動相:洗脫液A為甲醇,洗脫液B為pH為5.4的0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液;流動相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,在室溫下超聲脫氣30 min。采用二元流動相進(jìn)行梯度洗脫分離,檢測時間為23 min,其中甲醇0.05 mol/L磷酸二氫鉀隨時間配比為:0 min:0～100%;11 min:10%～90%;18 min:0～100%;23 min:0～100%。

1.2.5 味精當(dāng)量分析 鮮味氨基酸與核苷酸協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度相當(dāng)于一定濃度的單一味精所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度[19],即為味精當(dāng)量EUC(10-2g MSG/mL),計(jì)算式如下:

EUC=Σai×bi+1218(Σai×bi)(Σaj×bj)

式中:ai為鮮味氨基酸(Asp,Glu)的含量,g/100 mL;bi為鮮味氨基酸相對于谷氨酸鈉(MSG)的相對鮮度系數(shù),其中,Asp 的b值為0.077,Glu 的b值為1;aj為呈味核苷酸(5-IMP、5-GMP、5-AMP)的含量,g/100 mL;bj為呈味核苷酸相對于5-IMP 的相對鮮度系數(shù),其中,5-IMP 的b值為1,5-GMP的b值為2.3,5-AMP的b值為0.18。

1.2.6 肽分子質(zhì)量分布的測定 參照Chiang等[20]的方法,并稍作修改,采用高效液相色譜儀測定復(fù)合骨素酶解液分子量分布。色譜柱為TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm);柱溫:40 ℃;流動相:A為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸混合的45%(V/V)乙腈溶液;等梯度洗脫;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL,于214 nm波長下測定響應(yīng)值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

曲線圖的繪制采用origin 2017軟件,顯著性分析及相關(guān)性分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理,每個實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度分析

酶的種類及水解度對復(fù)合骨素酶解液的風(fēng)味有重要影響。圖1為四種組合酶對復(fù)合骨素酶解液水解度的影響,A+F與P+F酶解液的水解度最大,分別為10.67%和11.27%(P>0.05)。復(fù)合蛋白酶是由內(nèi)切蛋白酶、外切肽酶以及風(fēng)味蛋白酶復(fù)合而成的,具有較多的切割位點(diǎn),因此復(fù)合蛋白酶與外切風(fēng)味蛋白酶組合酶解后水解度大[21]。堿性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶,能夠切割芳香族或疏水性氨基酸殘基的肽鍵,再與風(fēng)味蛋白酶組合,其水解度也會相對較大[22]。N+F與B+F酶解液的水解度最小,分別為8.60%和8.40%,木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶,也稱為巰基蛋白酶,可作用于肽鏈中精氨酸和賴氨酸的羧基端,并對N-端具有二個羧基的氨基酸具有優(yōu)先水解性[23]。

圖1 蛋白酶對復(fù)合骨素酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of protease on the degree of hydrolysis of compound osteolysin hydrolysate注:不同小寫字母代表化合物在4種酶解液間的顯著性差異(P<0.05);圖2、表2～表5同。

2.2 游離氨基酸分析

蛋白酶的酶切位點(diǎn)決定了酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的組成及含量,使酶解產(chǎn)物中游離氨基酸組成有較大的差異,同時,游離氨基酸的組成及含量對酶解液滋味有著重要影響[24]。如表2所示,不同復(fù)合骨素酶解液中游離氨基酸含量存在較大差異,A+F酶解液的總氨基酸含量最高,P+F酶解液次之,這可能由于堿性蛋白酶主要裂解疏水性氨基酸,與風(fēng)味蛋白酶組合酶解后,制得的酶解液中含有大量的疏水性氨基酸[25]。復(fù)合蛋白酶是由多種蛋白酶復(fù)合而成,與風(fēng)味蛋白酶組合酶解后,可從肽鏈的任意一端切下一個單位氨基酸殘基,也可在多肽鏈的內(nèi)部破壞肽鍵,進(jìn)而提高蛋白水解度,并產(chǎn)生大量的游離氨基酸[26]。而N+F與B+F的水解度低,木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要為羧基端,易于釋放苦味氨基酸,且酶切位點(diǎn)特異性強(qiáng),所以N+F與B+F酶解液總游離氨基酸含量低。

表2 蛋白酶對復(fù)合骨素酶解液游離氨基酸的影響Table 2 Effect of protease on free amino acids in compound osteolysin hydrolysate

不同復(fù)合骨素酶解液中共檢測到17種游離氨基酸。氨基酸根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性不同,可分為呈鮮味、甜味、苦味、無味氨基酸,呈味氨基酸含量高可以增加酶解液的鮮味、濃厚感和豐富度[27]。鮮味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,這兩種氨基酸在A+F、P+F和N+F酶解液中含量較高,其中谷氨酸本身具有酸味,但和鈉鹽并存時,可以提供強(qiáng)烈的鮮味,是重要的鮮味氨基酸[28]。甜味氨基酸中的甘氨酸和丙氨酸在復(fù)合骨素酶解液中檢出量較高,甘氨酸除了增強(qiáng)甜味,還可以改善酶解液的苦味[29]。同時,谷氨酸和丙氨酸共存時產(chǎn)生協(xié)同作用,可增強(qiáng)酶解液的鮮味[30]。A+F、P+F和B+F酶解液中苦味氨基酸含量最高,同時A+F與P+F酶解液中苯丙氨酸和亮氨酸含量較N+F與B+F酶解液更高。無味氨基酸包括酪氨酸、半胱氨酸和賴氨酸,半胱氨酸可以增強(qiáng)酶解液的肉香味,其中P+F酶解液中半胱氨酸含量最高,肉香味更強(qiáng)[31]?？偟膩碚f,酶解液中的游離氨基酸能賦予食物特定的味感,為Maillard反應(yīng)制備熱反應(yīng)型肉味香精提供豐富底物。

2.3 呈味核苷酸分析

AMP、GMP、IMP是主要的低閾值呈鮮味物質(zhì),AMP由 ATP 降解產(chǎn)物生成還可以降解為IMP,GMP 是植物性食品如菌類食品中主要呈鮮物質(zhì),IMP 主要存在于動物性食品。AMP、GMP、IMP是肉類食品中主要的風(fēng)味核苷酸,有助于提升肉質(zhì)的鮮味[32]。本研究測定了四種復(fù)合骨素酶解液中3種核苷酸含量,如表3所示,四種酶解液中IMP含量最高,這可能由于復(fù)合骨素屬于肉類食品,自身就含有大量的IMP,酶解后得到大量釋放,以及AMP在酶解過程中發(fā)生降解反應(yīng),導(dǎo)致IMP含量相對于AMP和GMP較高[33-34]。同時,IMP與AMP有協(xié)同作用,且與天冬氨酸、谷氨酸等鮮味氨基酸共存時能增強(qiáng)復(fù)合骨素酶解液的鮮味和甜味[35]。四種酶解液中,A+F酶解液所含核苷酸含量最高,P+F酶解液次之,N+F酶解液核苷酸含量最低,有研究表明酶解液中水解度高低對核苷酸含量有影響[36],A+F與P+F酶解液的水解度較大,所以其核苷酸含量也相對較高。

表3 蛋白酶對復(fù)合骨素酶解液呈味核苷酸的影響Table 3 Effect of protease on taste-flavored nucleotides of compound osteolysin hydrolysate

2.4 味精當(dāng)量分析

EUC表示鮮味氨基酸與呈味核苷酸的混合物協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度,被用來衡量氨基酸與核苷酸的協(xié)同效應(yīng),是國際上通行的研究食品鮮味的分析方法[37]。如圖2所示,A+F酶解液的EUC值最高為4.26×10-2g MSG/mL,其次是P+F酶解液的EUC為3.83×10-2g MSG/mL,B+F酶解液的EUC最低為2.73×10-2g MSG/mL,EUC表示鮮味氨基酸及呈味核苷酸之間的協(xié)同效應(yīng),其值的大小由鮮味氨基酸及呈味核苷酸含量共同決定。復(fù)合蛋白酶其酶切位點(diǎn)廣泛,堿性蛋白酶主要裂解疏水性氨基酸,兩種酶分別與外切酶風(fēng)味蛋白酶組合酶解復(fù)合骨素,可增強(qiáng)酶解液水解度,產(chǎn)生大量游離氨基酸。因此,A+F與P+F酶解液的水解度大,其鮮味氨基酸和核苷酸含量也相對較高,有較為強(qiáng)烈的鮮味強(qiáng)度。同時,有研究表明甜味氨基酸與IMP協(xié)同作用可以增強(qiáng)鮮味[38],而A+F與P+F酶解液的甜味氨基酸含量與IMP核苷酸含量較N+F和B+F酶解液更高。

圖2 蛋白酶對復(fù)合骨素酶解液EUC的影響Fig.2 Effect of protease on EUC of compound osteolysin hydrolysate

2.5 肽分子量分布分析

多肽分子量分布是Maillard反應(yīng)的重要表征指標(biāo)之一。劉建彬[39]發(fā)現(xiàn)分子量<1000 Da的肽段更具有美拉德反應(yīng)活性,Toelstede等[40]發(fā)現(xiàn)分子量200～1000 Da的寡肽有獨(dú)特的增味作用。如表4所示,對比四種酶解液肽分子量分布發(fā)現(xiàn),總體肽分子量分布差異不大,肽段分子量分布主要集中于分子量1000～3000、200～500和<200 Da,這可能由于分子量1000～3000 Da肽段發(fā)生肽聚集和肽交聯(lián)作用,使得該肽段分子量分布較多,而酶解使得蛋白和大分子肽段降解為分子量<500 Da的小分子肽段,為之后的美拉德反應(yīng)提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)[41]。酶解液中小分子量肽所占比例越大,代表其水解程度越高,酶解效果越好。其中P+F和A+F酶解液中分子量<1000 Da肽段含量較高,說明P+F和A+F組合酶的水解度大、酶解效果好,這與2.1水解度分析中的結(jié)果一致。分子量<1000 Da肽段主要包括小肽、寡肽、小分子活性肽和游離氨基酸。復(fù)合骨素酶解過程中產(chǎn)生的肽類物質(zhì)對酶解液風(fēng)味的影響,主要是包括寡肽、游離氨基酸和其他呈味物質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用,使酶解液風(fēng)味飽滿、口感協(xié)調(diào)。分子量<1000 Da肽段含量高的酶解液,其呈味肽的含量也可能相應(yīng)較高[42-43]。根據(jù)水解度和分子量<1000 Da肽段含量的差異,說明P+F和A+F組合酶制備復(fù)合骨素酶解液的呈味效果明顯優(yōu)于N+F和B+F組合酶。

表4 蛋白酶對復(fù)合骨素酶解液肽分子量分布的影響Table 4 Effect of protease on molecular weight distribution of compound osteolysin hydrolysate

2.6 主成分分析

為了進(jìn)一步明確酶種類對復(fù)合骨素酶解液呈味物質(zhì)的影響,利用SPSS 19.0對四種酶解液的水解度、鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、無味氨基酸、IMP、GMP、AMP、EUC、分子量<1000 Da的肽段進(jìn)行主成分分析(Principle component analysis,PCA)。將10維度的呈味物質(zhì)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并分析各指標(biāo)變量間的相關(guān)性,得到各指標(biāo)間的相關(guān)矩陣。如表5所示,經(jīng)PCA特征提取的前2個主成分,其特征值均大于1,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到96.633%,基本涵蓋反映了所有變量的初始信息,因此,選取前2個主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。

表5 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalue and contribution rate of principal components

由10個指標(biāo)的荷載系數(shù)與特征值計(jì)算得到10個因子的特征向量(見表6)。以特征向量為系數(shù)構(gòu)建2個主成分的線性方程,如下所示:

主成分1的特征方程為:

Y1=0.320X1+0.287X2+0.252X3+0.341X4+0.331X5+0.331X6+0.327X7+0.315X8+0.325X9+0.322X10

主成分2的特征方程為:

Y2=-0.307X1-0.442X2+0.548X3-0.164X4+0.018X5-0.143X6+0.27X7+0.322X8+0.295X9-0.316X10

上述式中:Xi為標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù),i=0,1,2,…,10。

表6 主成分的載荷矩陣和特征向量Table 6 Principal loading matrix and component eigenvectors

表7 四種復(fù)合骨素酶解液呈味物質(zhì)綜合得分Table 7 Comprehensive scores of four kinds of compound bone enzymatic hydrolysates

N+F與B+F酶解液綜合得分為負(fù)值,且B+F酶解液綜合得分值最小。A+F與P+F酶解液綜合得分為正值,A+F酶解液綜合得分值最大,說明使用A+F組合酶酶解復(fù)合骨素呈味物質(zhì)含量更高,為后續(xù)美拉德反應(yīng)提供更多反應(yīng)物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以復(fù)合骨素為原料,采用四種組合酶酶解復(fù)合骨素,探究酶種類對復(fù)合骨素呈味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明,A+F和P+F酶解液的水解度最大分別為10.67%和11.27%;對呈味游離氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn),A+F和P+F酶解液的總游離氨基酸含量最高,P+F酶解液中半胱氨酸含量最高,肉香味更強(qiáng);A+F酶解液的總核苷酸含量和EUC值最大;A+F和P+F酶解液分子量<1000 Da肽段含量最高,制備復(fù)合骨素酶解液的呈味效果更好;利用PCA綜合分析10個檢測指標(biāo),得到A+F組合酶的綜合得分最高,表明A+F酶解液為后續(xù)復(fù)合骨素酶解液美拉德反應(yīng)提供更多的反應(yīng)前體物質(zhì),更適合酶解復(fù)合骨素。復(fù)合骨素酶解液含有豐富的游離氨基酸和小分子活性肽,未來的研究可進(jìn)一步開展復(fù)合骨素酶解液中的小分子肽種類的分離鑒定,研究美拉德反應(yīng)條件、添加物種類對復(fù)合骨素酶解液呈味特性、功能特性和生理活性的影響,為復(fù)合骨素深加工利用提供理論參考。