龍奧亞,閆淑珍,陳雙林(南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023)

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)是1994年由Steyaert建立命名的一類具有重要經濟價值的無性型真菌[1]。1996年,Strobel等從落羽杉的內生真菌Pestalotiopsismicrospora液體發(fā)酵產物中發(fā)現能夠抗癌的物質紫衫醇之后,該屬真菌成為研究真菌代謝產物的重要物種[2]。據報道,已從擬盤多毛孢屬中分離得到約200多種化合物,包括萜類、酯類、醌類、香豆素類、多肽類、內酯類、生物堿及色酮類化合物等[3]。擬盤多毛孢屬真菌的代謝產物復雜多樣,除常見的化合物外,也分離得到許多結構新穎且活性顯著的代謝產物。Lei等[4]從分離自海綿Phakelliafusca的異角狀擬盤多毛孢Pestalotiopsisheterocornis發(fā)酵物中分離得到2個化合物,分別是heterocornol C和heterocornol G。heterocornol C對人肺癌細胞H460有抑制作用,IC50值為18.7 μmol/L,陽性對照阿霉素的IC50值為1.48 μmol/L。heterocornolG對人胃癌細胞BGC-823、人前列腺癌細胞PC-3和人肝癌細胞SMMC-7721有抑制作用,IC50值分別為15.0、21.3、20.2 μmol/L,陽性對照阿霉素的IC50值分別為1.48、1.80、2.24 μmol/L。Zhang等[5]從一株未鑒定的Pestalotiopsissp. ZJ-2009-7-6發(fā)酵液中分離得到腦苷類化合物(4E,8E)-N-D-2′-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyranosly-9-methyl-4,8-sphingadienine,對單純皰疹病毒(HSV)及腸道病毒71(EV71)均表現出抑制活性,IC50分別達到16.1和74.3 μmol/L。Kuang等[6]從一株未鑒定的Pestalotiopsissp. M-23固體發(fā)酵物中分離得到1個drimane類倍半萜化合物11-dehydro-3a-hydroxyisodrimeninol,對枯草芽胞桿菌表現出抑制活性,IC50值為280.27 μmol/L。Xia等[7]從分離自蘆葦的擬盤多毛孢菌Pestalotiopsissydowiana發(fā)酵物中分離得到pestalotiopyrone G,表現出強蛋白酶抑制活性,IC50為(1.2±0.3) μmol/L,陽性對照環(huán)氧霉素的IC50值為0.072 μmol/L。

擬盤多毛孢屬真菌,分布廣泛,至今已報道了200多個種的名稱[3]。其模式菌種為葡萄盤多毛孢Pestalotiposisperioides,分生孢子具有6個細胞,中間4個細胞著色較深,兩端為無色透明細胞,具有2根及以上頂生附屬絲[8]。相近的屬有盤多毛孢屬(Pestalotia)、五隔盤單毛孢屬(Seiridium)、盤單毛孢屬(Monochaetia)、截盤多毛孢屬(Truncatella)[9]。擬盤多毛孢屬與相近的屬在分生孢子數目、顏色;附屬絲、載孢器等方面形態(tài)特征相近,增加了分類的難度。擬盤多毛孢屬真菌擁有豐富的活性代謝產物,包括抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲活性等,已成為很多活性代謝產物的主要來源[10]。由于鑒定到種比較困難,多數報道都是以未知種的名稱出現,超過一半的擬盤多毛孢屬真菌尚未有代謝產物方面的報道。因此,目前對于擬盤多毛孢屬真菌資源的鑒定和代謝產物研究尤為重要。

本研究對16072314菌株進行分類學鑒定和次生代謝產物分析。為促進擬盤多毛孢屬真菌的資源開發(fā)與利用和獲得具有高經濟價值的真菌代謝產物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16072314菌株 分離自葡萄狀枝瑚菌子實體,由本實驗室保藏;葡萄糖、瓊脂條 上海生工生物技術有限公司;馬鈴薯、大米 江蘇南京亞東新城華潤蘇果超市;食用菌栽培袋 湖北京山縣新市鎮(zhèn)成林菌業(yè)店;PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200.0,葡萄糖20.0,瓊脂條20.0;大米培養(yǎng)基(g/袋):200.0,pH自然,121 ℃滅菌30 min,每隔12 h滅菌1次,共滅菌2次;ITS-PCR擴增引物(ITS1、ITS4)、PCR mix(2×Taq mix) 上海生工生物技術有限公司;柱色譜用硅膠和薄層色譜用硅膠GF254(200～300目,50～71 μm) 青島海洋化工廠生產;羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 上海源葉生物科技有限公司;薄層層析硅膠GF254200～300目 青島海洋化工廠;甲醇色譜級 美國天地有限公司;二氯甲烷、石油醚等分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GXZ型智能光照培養(yǎng)箱 南京同立實驗儀器有限公司;C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀 美國伯樂公司;Power Pac 2000電泳儀 美國伯樂公司;Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司;CA-1390-1垂直層流潔凈超凈臺 上海凈化設備有限公司;DHZ-C大容量恒溫振蕩器 江蘇太倉實驗設備廠;BX53F顯微鏡 日本Olympus公司;1220型分析型高效液相、1100與1200系列制備型高效液相、1290 Infinity LC/6460 QQQ MS液相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;AVANCE III HD 400型核磁共振儀(TMS為內標) 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的形態(tài)學鑒定 采用轉接法:用滅菌的接種環(huán)從本實驗室保藏16072314菌株的試管斜面上挑取少量菌絲,在含有PDA培養(yǎng)基的平板中劃線接種。置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后,挑取單菌落重新接種于PDA培養(yǎng)基中進行活化。從活化好的16072314菌株的平板中,挑取一塊長勢均勻1 cm×1cm的菌塊,轉接于PDA培養(yǎng)基的平板上,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中在26 ℃下培養(yǎng),觀察并記錄菌落的形態(tài)特征。

采取直接挑取制片法:以蒸餾水為浮載劑,用滅菌的解剖針在16072314菌株26 ℃,培養(yǎng)7 d后的平板菌落中挑取小黑點,小氣泵輕輕吹散,使孢子分散均勻,制成玻片;同時用滅菌的解剖針輕輕挑取靠近培養(yǎng)基下層的小黑點,用滅菌的解剖刀輕輕切片,制成玻片;分別在顯微鏡下觀察分生孢子和載孢器并記錄。

1.2.2 菌株的分子生物學鑒定 采用CTAB法[11]提取真菌基因組DNA并作為模板,以通用引物:ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對菌株進行ITS區(qū)域擴增。PCR反應體系為:12.5 μL PCR mix(2×Taq mix),10 μmol/L ITS1,ITS4各1 μL,DNA模板1 μL,加無菌水至25 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min,94 ℃變性30s,55 ℃退火45s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次,72 ℃溫育10 min。取5 μL PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下檢測。測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。使用SeqMan(DNAStarInc,USA)軟件仔細對照測序峰圖與堿基序列進行檢查分析和校正后,用BLAST軟件在GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST)中進行同源性比對,選取有詳細信息的參考菌株和外群菌株,Mega7.0做Clust W多重比對分析,并進行1000次自檢,構建NJ(Neighbor-Joining,NJ)系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 菌株發(fā)酵 保藏菌種接種到PDA培養(yǎng)基平板上,26 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取3個活化后的長勢均勻1 cm×1 cm大小的菌塊,轉接到裝有100 mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,26 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d。取種子液并用無菌水配成濃度為1×104個/mL的菌懸液。取10 mL上述菌懸液轉接于裝有大米固體培養(yǎng)基的17×35×5 cm3栽培袋中,混勻于26 ℃靜止培養(yǎng)35 d,共發(fā)酵20袋。發(fā)酵產物于55 ℃下烘干,粉碎并稱重以備用。

1.2.4 產物的分離與純化 將烘干粉碎后的固體發(fā)酵料用甲醇浸提至無色,減壓濃縮,獲得粗提物41.92 g。粗體物經硅膠柱色譜分離,以二氯甲烷/甲醇(19∶1、17∶3、13∶7、1∶1、9∶1)梯度洗脫,TLC檢測并進行合并,得到F1～F5五個部分。F1部分重結晶得到化合物3(20 mg)。F2部分經反復硅膠柱色譜,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1)梯度洗脫,其中9∶1部分經重結晶得到化合物7(12 mg),1∶1部分經制備薄層色譜分離得到化合物1(16 mg)。F3部分經反復硅膠柱色譜,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1,4∶1,7∶3,3∶2,1∶1)梯度洗脫,其中9∶1部分經半制備高效液相色譜分離得到化合物5(12 mg),7∶3部分經半制備高效液相色譜分離得到化合物4(28 mg)。F4部分反復經硅膠柱色譜,以二氯甲烷/甲醇(100∶1～10∶1)梯度洗脫,其中90∶1部分經Sephadex LH-20分離和半制備高效液相色譜分離到化合物6(21 mg),40∶1部分經半制備高效液相色譜分離得到化合物2(12 mg)。F5部分經反復硅膠柱色譜、Sephadex LH-20分離和半制備高效液相色譜得到化合物8(10 mg)。

1.2.5 結構鑒定 采用液相色譜-質譜聯用儀和核磁共振波譜儀對化合物的結構進行鑒定。液相色譜條件:色譜柱:SunFireTMC18反相色譜柱(4.6×250 mm,5 μm);流動相比例:70%色譜甲醇;流速:0.6 mL/min;進樣量:20 μL;二極管陣列檢測器波長:254 nm;柱溫箱5～95 ℃;工作壓力0～15000 psi;控溫自動進樣器:4～60 ℃;質譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI);模式:正、負離子模式;掃描范圍:m/z為5～3000;分辨率:R≥2.5 M。核磁條件:根據AVANCE III HD 400型核磁共振儀的相應參數設置,TMS為內標。

1.3 數據處理

質譜數據通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件處理,獲得各化合物的分子量信息。核磁共振波譜數據通過MestReNova軟件處理,獲得相應的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 結果與分析

2.1 菌株的菌落形態(tài)和顯微特征

PDA培養(yǎng)基上白色菌落生長蓬松,棉絮狀,背面無色素積淀,約7 d后菌落里面和菌絲表面出現散落的小黑點即分生孢子堆。載孢體為分生孢子盤,表皮下生,由淺褐色薄壁角細胞組成,直徑100～240 μm。分生孢子紡錘形,直或稍彎曲,大小為(20～26) μm×(5～6.1) μm;5個細胞,中間3個細胞暗色,較大,近圓柱形;兩端細胞無色,較小,近三角形。頂端附屬絲2～3條,多數3條、長5～17.8 μm,基部附屬絲2.5～5 μm(圖1)。根據形態(tài)學觀察,參考宋玉等[12]對擬盤多毛孢屬真菌形態(tài)特征描述的特點,初步確定16072314菌株為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)真菌。

圖1 16072314菌株的形態(tài)和顯微特征Fig.1 Morphology and microscopic characteristics of the 16072314 strain注:A:PDA培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(正面)；B:PDA培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(背面)。C:分生孢子顯微特征(40×);D:分生孢子器顯微特征(40×);標尺:C=10 μm;D=50 μm。

2.2 基于ITS序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

通過PCR方法擴增16072314菌株的ITS區(qū),獲得目的片段414 bp,上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的序列號為:MT364494。采用BLAST程序與GenBank數據庫中收錄序列比對,結果獲得16072314菌株的ITS區(qū)序列與序列號LC206587.1的木防己擬盤多毛孢一致性高達100%。根據NJ系統(tǒng)進化樹發(fā)現:16072314菌株與木防己擬盤多毛孢聚在同一分支中,自檢支持率達95%。整個系統(tǒng)發(fā)育樹成為4個大的分支,外群Robillardasessilis作為一個單獨分支,2株Pestalotiopsisvismiae和2株Pestalotiopsismicrospora以97%的自檢支持率聚在同一分支;3株Pestalotiopsiscamelliae以99%的自檢支持率聚在同一分支(圖2)。

圖2 根據ITS序列建立的擬盤多毛孢屬內種間的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree established according to 16072314 strain’s ITS sequence

綜合形態(tài)學觀察和分子生物學檢測結果,以吳文能等[13]和秦紹釗等[14]對木防己擬盤多毛孢的形態(tài)學描述為參照,確定16072314菌株的分類學地位為擬盤多毛孢屬的木防己擬盤多毛孢Pestalotiopsiscocculi。擬盤多毛孢屬的大多數種,一般以植物內生真菌的形式存在,或者以植物病原菌、腐生菌的形式存在。少數從動物體表中分離得到,例如古玉等[15]從大熊貓體表分離得到一株海南擬盤多毛孢Pestalotiopsishainanensis。目前尚未有在食用菌子實體中分離得到的報道。

2.3 化合物結構的波譜鑒定

共分離、鑒定出8個成分,在粗提物中的提取率分別為7-羥基香豆素(0.38%)、阿魏酸(0.29%)、麥角甾醇(0.48%)、對羥基苯甲醛(0.67%)、對羥基苯乙醇(0.29%)、齊墩果酸(0.5%)、β-谷甾醇(0.29%)和過氧麥角甾醇(0.24%)?；衔锝Y構見圖3。

圖3 化合物1～8的結構式Fig.3 Structures of compounds 1～8

化合物1:淺黃色粉末,ESI-MS:m/z 185.1[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 10.55(1H,s,-OH),7.93(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),6.79(1H,dd,J=8.4,2.3 Hz,H-6),6.72(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=9.4 Hz,H-3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 102.6(C-3),111.7(C-8),111.9(C-10),113.6(C-6),130.2(C-5),145.0(C-4),156.0(C-7),160.9(C-9),161.7(C-2)。上述NMR數據與文獻[16]對照一致,鑒定為7-羥基香豆素。

化合物2:白色粉末,ESI-MS:m/z 193.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.53(1H,s,4-OH),7.49(1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.28(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.08(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.36(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.82(3H,s,-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 56.1(-OCH3),111.4(C-2),115.8(C-5),116.0(C-8),123.2(C-6),126.2(C-1),145.3(C-7),148.3(C-3),149.3(C-4),168.8(C-9)。上述NMR數據與文獻[17]對照一致,鑒定為阿魏酸。

化合物3:白色針狀結晶(石油醚),ESI-MS:m/z 419.3[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.59(1H,dd,J=5.7,2.5 Hz,H-6),5.40(1H,dt,J=5.6,2.8 Hz,H-7),5.31-5.01(2H,m,H-22,23),3.74-3.47(1H,m,H-3),1.06(3H,d,J=6.7 Hz,H-21),0.97(3H,s,H-19),0.94(3H,d,J=6.8 Hz,H-28),0.85(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.84(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.65(3H,s,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 12.0(C-18),16.3(C-19),17.6(C-28),19.6(C-27),19.9(C-26),21.1(C-21,11),23.0(C-15),28.3(C-16),32.0(C-2),33.1(C-25),37.0(C-10),38.4(C-1),39.1(C-12),40.4(C-20),40.8(C-4),42.8(C-13,24),46.2(C-9),54.5(C-14),55.7(C-17),70.5(C-3),116.3(C-7),119.6(C-6),132.0(C-23),135.6(C-22),139.8(C-5),141.4(C-8)。以上數據與文獻[18]相同,鑒定為麥角甾醇。

化合物4:黃色粉末,ESI-MS:m/z 121.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.79(s,1H,-CHO),7.76(d,J=8.7 Hz,2H,H-2,6),6.94(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 191.4(-CHO),163.8(C-4),132.6(C-2,6),128.8(C-1),116.3(C-3,5)。以上數據與文獻[19]相同,鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物5:白色粉末,ESI-MS:m/z 137.1[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.12(s,1H,-OH),6.99(d,J=8.5 Hz,2H,H-2,6),6.66(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5),4.57(t,J=5.2 Hz,1H,-OH),3.52(td,J=7.3,5.3 Hz,2H,H-8),2.60(t,J=7.3 Hz,2H,H-7)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ155.9(C-4),130.1(C-2,6),129.9(C-1),115.4(C-3,5),63.1(C-8),38.7(C-7)。以上數據與文獻[20]相同,鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物6:白色粉末,ESI-MS:m/z 479.0[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 5.17(d,J=4.0 Hz,1H,H-12),3.03(m,1H,H-3),2.75(dd,J=13.9,4.5 Hz,1H,H-18),1.10,0.90,0.88,0.87,0.86,0.72,0.68(s,21H,7×CH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 15.6(C-24),16.5(C-25),17.3(C-26),18.5(C-6),23.1(C-11),23.4(C-16),23.8(C-30),26.1(C-27),27.4(C-2),27.7(C-15),28.7(C-23),30.9(C-20),32.6(C-22),32.9(C-7),33.3(C-29),33.8(C-21),37.1(C-10),38.5(C-1),38.8(C-4),39.3(C-8),41.3(C-18),41.8(C-14),45.9(C-19),46.1(C-17),47.5(C-9),55.3(C-5),77.3(C-3),122.0(C-12),144.3(C-13),179.0(C-28)。以上數據與文獻[21]相同,鑒定為齊墩果酸。

化合物7:白色針狀結晶(氯仿),ESI-MS:m/z 437.2[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.37(m,1H,H-6),3.55(m,1H,H-3),1.03(s,3H,H-19),0.93(d,J=6.5,3H,H-21),0.83-0.88(9H,H-26,27,29),0.70(s,3H,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 11.9(C-29),12.0(C-18),18.8(C-21),19.0(C-27),19.4(C-19),19.8(C-26),21.1(C-11),23.1(C-28),24.3(C-15),26.1(C-23),28.3(C-16),29.1(C-25),31.7(C-2),31.9(C-7),31.9(C-8),33.9(C-22),36.2(C-20),36.5(C-10),37.3(C-1),39.8(C-12),42.3(C-4),42.3(C-13),45.8(C-24),50.1(C-9),56.1(C-17),56.8(C-14),71.8(C-3),121.7(C-6),140.8(C-5)。以上數據與文獻[22]相同,鑒定為β-谷甾醇。

化合物8:白色針狀結晶(丙酮),ESI-MS:m/z 429.3[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 6.53(d,J=8.5 Hz,1H,H-7),6.26(d,J=8.5 Hz,1H,H-6),5.24(dd,J=15.2,7.4 Hz,1H,H-22),5.16(dd,J=15.3,8.2 Hz,1H,H-23),3.99(m,1H,H-3),1.02(d,J=6.6 Hz,3H,H-21),0.93(d,J=6.8 Hz,3H,H-28),0.90(s,3H,H-19),0.85(d,J=6.6 Hz,3H,H-27),0.84(s,3H,H-18),0.83(d,J=6.6 Hz,3H,H-26)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 135.4(C-6),135.2(C-22),132.3(C-23),130.8(C-7),82.2(C-5),79.4(C-8),66.5(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1(C-9),44.6(C-13),42.8(C-24),39.8(C-20),39.3(C-12),37.0(C-4),36.9(C-10),34.7(C-1),33.1(C-25),30.1(C-2),28.7(C-15),23.4(C-11),20.9(C-16),20.6(C-21),20.0(C-27),19.7(C-26),18.2(C-19),17.6(C-28),12.9(C-18)。以上數據與文獻[23]相同,鑒定為過氧麥角甾醇。

從木防己擬盤多毛孢固體發(fā)酵物甲醇浸膏中提取的物質,主要可以分為酚酸類、甾醇類及三萜類化合物。阿魏酸屬于酚酸類化合物,提取率為0.29%。阿魏酸僅在少數其他真菌[24]代謝產物中發(fā)現,鑒于此,16072314菌株可以作為工業(yè)化生產阿魏酸的潛力菌種。麥角甾醇、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇屬于甾類化合物,提取率分別是0.48%、0.29%和0.24%。而Xing等[25]從異角狀擬盤多毛孢Pestalotiopsishetercornis大米固體發(fā)酵物中分離得到麥角甾醇、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇,提取率分別是0.15%、0.12%和0.11%。齊墩果酸屬于三萜類化合物,提取率為0.5%,王艷穎等[26]從番石榴葉內生真菌Pestalotiopsiszonata液體發(fā)酵產物中分離得到齊墩果酸,提取率為0.38%。通過與擬盤多毛孢真菌屬類似研究中的提取率相比,本研究中甾醇類及三萜類化合物的提取率均有所提高,為木防己擬盤多毛孢真菌資源的利用提供可靠依據。

3 結論

本研究采用形態(tài)學觀察結合ITS序列分析法將16072314菌株鑒定為木防己擬盤多毛孢,該菌株為首次從食用菌子實體中分離得到。綜合運用多種天然產物分離技術對木防己擬盤多毛孢次生代謝產物進行分離純化,得到了高純度的8種化合物,分別是7-羥基香豆素、阿魏酸、麥角甾醇、對羥基苯甲醛、對羥基苯乙醇、齊墩果酸、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇。8個化合物均為首次從木防己擬盤多毛孢中分離得到,阿魏酸在擬盤多毛孢屬真菌中為首次發(fā)現。本文明確了木防己擬盤多毛孢的化學成分,為評價其生物活性和應用前景提供了科學依據。