苗春雷,朱新貴(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植最廣的谷物,其產(chǎn)量和消費(fèi)量約占世界谷物消費(fèi)量的30%[1]。作為全世界多數(shù)國家和民族的主糧,小麥以及以小麥為基礎(chǔ)的食物為人類提供了大量的碳水化合物和蛋白質(zhì)[2]。小麥籽粒因富含淀粉,使其除直接用做人類口糧外,也作為發(fā)酵工業(yè)中常用的淀粉質(zhì)原料[3]。將小麥淀粉水解后,產(chǎn)生的水解糖廣泛用作多種發(fā)酵產(chǎn)品的原料,如用于發(fā)酵生產(chǎn)酒類、調(diào)味品、有機(jī)酸、藥物等。

小麥作為發(fā)酵原料時(shí),首先通常會被粉碎[4-5],然后進(jìn)行糖化處理產(chǎn)生糖化液用于發(fā)酵,小麥中其他宏量成分,如蛋白質(zhì)及膳食纖維很少或幾乎不被利用[6],最終以殘?jiān)男问搅舸嫦聛?造成產(chǎn)品分離困難。小麥一般含有蛋白質(zhì)8%～15%、膳食纖維10%～13%[7-8],是較為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白和膳食纖維。由于現(xiàn)有小麥的發(fā)酵過程只注重其淀粉質(zhì)的利用,在工藝設(shè)計(jì)上以快速高效轉(zhuǎn)化淀粉進(jìn)行糖化為主[9],蛋白質(zhì)和膳食纖維往往很難被回收和有效利用[10],從而造成浪費(fèi)。

隨著技術(shù)的發(fā)展,高酶活性及穩(wěn)定性的酶制劑成本降低,因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物及其副產(chǎn)物中宏量組分的水解及回收[11-13]。本研究試圖使用完整的小麥顆粒作為原料,分層水解其宏量組分,并分離回收水解產(chǎn)物,用于幾種相關(guān)產(chǎn)品的同步分制,避免小麥中各主要宏量組分的浪費(fèi)。材料全過程保持顆粒狀態(tài),有利于分層水解產(chǎn)物的分離。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥顆粒(龍94-4083) 購自黑龍江洪波農(nóng)產(chǎn)品有限公司;高溫α-淀粉酶(180000 U/mL,來自地衣芽孢桿菌) 購自寧夏夏盛實(shí)業(yè)有限公司;葡萄糖淀粉酶AG 300L?(260 AGU/mL,來自黑曲霉) 購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme?(15000 U/g,來自米曲霉) 購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑 均為分析純。

HWS26型電熱恒溫水浴鍋、F-10L型單層玻璃反應(yīng)釜 上海盟昆儀器設(shè)備有限公司;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;759紫外線可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;DZF系列真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;S-433D型氨基酸分析儀 德國賽卡姆公司;TGL-16GR型高速臺式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司;ME204E型分析天平 上海微川精密儀器有限公司;手持折光儀 上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理及成分測定 使用機(jī)械法脫去小麥顆粒的表皮,獲得脫皮后的小麥顆粒,并測定其淀粉、蛋白質(zhì)、水不溶性膳食纖維、脂肪、灰分含量。

1.2.2 小麥顆粒分層定向水解的流程 小麥顆粒中各宏量組分的水解及各級產(chǎn)物回收的工藝流程圖如圖1所示。

圖1 小麥顆粒分層定向水解流程圖Fig.1 Process of wheat grain gradual hydrolysis

1.2.2.1 小麥顆粒淀粉的液化 稱取小麥顆粒100 g置于1000 mL錐形瓶中,按料液比1∶4的比例加入蒸餾水,將錐形瓶置于95 ℃的水浴中,按15 mmol/L的濃度加入氯化鈣,以在高溫下維持淀粉酶的穩(wěn)定性[14]。使用1 mol/L氫氧化鈉將溶液pH調(diào)節(jié)至6.0并在整個(gè)反應(yīng)過程中維持。待料液溫度達(dá)到95 ℃時(shí),加入高溫α-淀粉酶,酶添加量30 μL/100 g(基于原料干重)。在反應(yīng)過程中,每0.5 h搖勻料液,吸取水解液測定可溶性固形物含量,同時(shí)取樣適量的小麥籽粒進(jìn)行研磨,根據(jù)碘顯色法判斷麥粒中淀粉殘留情況[15]。

1.2.2.2 小麥顆粒淀粉液化產(chǎn)物的糖化 將液化完成后的料液迅速用冷水浴冷卻至糖化反應(yīng)所需溫度(60.0 ℃)并維持。用1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)料液pH至4.0并維持。根據(jù)初始小麥顆粒的干物質(zhì)含量以12 μL/g添加葡萄糖淀粉酶進(jìn)行水解,每小時(shí)取樣測定糖化液中的還原糖含量。反應(yīng)結(jié)束后,過濾分離得到小麥糖化液,濾渣用水按照料液比1∶3的比例洗滌數(shù)次,直至洗滌后洗滌液的pH為中性。將濾出固體在65 ℃下干燥后即得脫淀粉小麥殘?jiān)?測定其蛋白質(zhì)、水不溶性膳食纖維、脂肪、灰分、還原糖含量。

1.2.2.3 脫淀粉麥粒蛋白質(zhì)的水解 稱取40 g干燥后的脫淀粉麥粒置于1000 mL錐形瓶中,按料液比1∶10的比例加入蒸餾水,使用包含內(nèi)肽酶及外肽酶的風(fēng)味蛋白酶[16]進(jìn)行水解。水解條件根據(jù)Choi等[17]水解面筋蛋白的方法稍作修改,將水浴溫度設(shè)定為50 ℃,待料液達(dá)到溫度后根據(jù)脫淀粉麥粒的干物質(zhì)含量,以60 U/g添加風(fēng)味蛋白酶,反應(yīng)期間使用1 mol/L氫氧化鈉將料液pH維持于7.0。反應(yīng)期間每2 h測定一次氨基酸態(tài)氮含量。反應(yīng)結(jié)束后,過濾分離蛋白質(zhì)水解液分析其氨基酸組成。將濾渣用水按料液比1∶5的比例洗滌5次,獲得的小麥殘?jiān)?5 ℃干燥后測定其總氮、水不溶性膳食纖維、脂肪、灰分含量。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 小麥宏量組分及其他化學(xué)成分的測定 蛋白質(zhì)含量的測定根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5-2016)中自動凱氏定氮法進(jìn)行(N×5.7)[18];淀粉含量測定根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中淀粉的測定》(GB 5009.9-2016)中酸水解法進(jìn)行[19];水不溶性膳食纖維含量的測定根據(jù)Van Soest的洗滌方法進(jìn)行[20];脂肪含量的測定根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脂肪的測定》(GB 5009.6-2016)中的方法進(jìn)行[21];灰分含量的測定根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中灰分的測定》(GB 5009.4-2016)中的方法進(jìn)行[22]。

1.3.2 可溶性固形物的測定 使用手持折光儀進(jìn)行測定。

1.3.3 還原糖含量的測定 根據(jù)趙凱等的DNS法進(jìn)行[23]。

1.3.4 糖化液的葡萄糖當(dāng)量(DE)的測定 根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《淀粉水解產(chǎn)品還原力和葡萄糖當(dāng)量測定》(GB/T 22428.1-2008)中的方法進(jìn)行[24]。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮的測定 根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中氨基酸態(tài)氮的測定方法》(GB 5009.235-2016)中乙酰丙酮-甲醛比色法進(jìn)行[25]。

1.3.6 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測定 根據(jù)厲望等的方法[26]進(jìn)行。

1.3.7 蛋白酶水解產(chǎn)物的全氮利用率的計(jì)算 根據(jù)陳怡均等的方法進(jìn)行[27]。

1.3.8 蛋白酶水解產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的測定 使用比色法測定水解液中氨基酸態(tài)氮含量[22],凱氏定氮法測定水解液中總氮含量[15],按式(1)計(jì)算氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率。

氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率(%)=水解液中氨基酸態(tài)氮含量/水解液中總氮含量×100

式(1)

1.3.9 水解產(chǎn)物氨基酸組成分析 過濾分離殘?jiān)?吸取2 mL蛋白質(zhì)水解液與4 mL磺基水楊酸溶液(6 wt%)混合,靜置1 h后以12000 r/min離心10 min。將上清液稀釋5倍,通過0.22 μm膜過濾,使用自動氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

HPLC柱:LCA K07/Li,流動相:檸檬酸鋰A=pH2.90;m/z 295。B=pH4.20。C=pH8.00,溫度:梯度溫度38～74 ℃,流速:洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min。分析時(shí)間:130 min。氨基酸組成結(jié)果表述為每毫升水解產(chǎn)物中的毫克氨基酸。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次,結(jié)果表示為三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。數(shù)據(jù)處理及繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥顆粒中的主要組分

圖2為脫皮后的小麥顆粒外觀形態(tài),其主要組分及含量由表1所示。測得小麥顆粒中的宏量組分有淀粉、蛋白質(zhì)及膳食纖維,其中淀粉占小麥顆粒干重70%以上。因此本研究首先針對淀粉進(jìn)行水解回收,以使顆粒內(nèi)部暴露更大接觸面積便于后續(xù)蛋白酶的水解。

圖2 脫皮后的小麥顆粒Fig.2 Peeled wheat grains

表1 小麥顆粒的主要組分及含量(干重,%)Table 1 Main components and contents of wheat grains(dry weight,%)

2.2 小麥顆粒淀粉的水解

2.2.1 淀粉的液化 在pH為6.0,溫度95 ℃,高溫α-淀粉酶添加量30 μL/100 g的水解條件下,經(jīng)過5.5 h反應(yīng)后在小麥顆粒中已檢測不到淀粉,證明完整小麥顆粒作為底物時(shí),其內(nèi)部淀粉仍可被水解完全。此時(shí)料液中可溶性固形物含量達(dá)到15.15%(圖3),且繼續(xù)反應(yīng)可溶性固形物含量不再增加。由于底物與料液及酶的接觸面積不同,顆粒狀原料中淀粉的液化時(shí)間長于粉狀原料所需的約40～70 min[28-29]。但液化5.5 h后料液DE值達(dá)到28.44%,高于短時(shí)間液化所得到的19.01%～23.61%[28-29],這是因α-淀粉酶隨機(jī)作用于α-1,4葡萄糖苷鍵將淀粉水解,所以在長時(shí)間的水解過程中葡萄糖得到積累,這對于本試驗(yàn)以糖化液作為目標(biāo)產(chǎn)物是有利的。

圖3 高溫α-淀粉酶水解過程中料液可溶性固形物變化趨勢Fig.3 Trend of soluble solids in feed liquid during thermostable α-amylase hydrolysis

2.2.2 淀粉液化產(chǎn)物的糖化結(jié)果 在pH為4.0,溫度60 ℃,葡萄糖淀粉酶添加量12 μL/g的水解條件下,糖化液中還原糖含量逐漸增加并在6 h達(dá)到最大值(圖4),此時(shí)還原糖含量已達(dá)到14.01 g/100 g,DE值為92.48%。在繼續(xù)反應(yīng)過程中,料液中還原糖含量并未繼續(xù)增加且有略微下降。這可能是產(chǎn)生的葡萄糖發(fā)生了復(fù)合反應(yīng)[30],或與原料中的含氮物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)所消耗。由此確定最佳糖化反應(yīng)時(shí)間為6 h。糖化結(jié)束后迅速冷卻樣品并將殘?jiān)鼮V出。本試驗(yàn)所得糖化液的DE值接近純小麥淀粉或糊精制糖所能達(dá)到的94.8%～99.5%[31-32],并確定完整小麥顆粒中的淀粉可以被徹底水解并得到充分的回收,同時(shí)小麥顆粒可以維持完整的團(tuán)粒結(jié)構(gòu),且所得糖化液較純,可直接用做食品原料或發(fā)酵工業(yè)碳源所需。

圖4 葡萄糖淀粉酶處理下糖化液中還原糖含量隨時(shí)間變化趨勢Fig.4 Trend of reducing sugar content in saccharification liquid treated with glucoamylase

2.2.3 脫淀粉殘?jiān)械闹饕M分 分離小麥糖化液后回收到22.81%的脫淀粉殘?jiān)?水分含量為4.27%),其形態(tài)如圖5所示。脫淀粉殘?jiān)饕煞钟杀?所示,其蛋白質(zhì)含量為46.72%(回收率為90.06%),粗纖維含量為38.92%(回收率為87.06%)。存在少量蛋白質(zhì)及纖維碎屑混合于糖化液中在實(shí)驗(yàn)室條件下不易回收,但總體回收率較高。同時(shí)得到的脫淀粉麥粒中還原糖含量僅為2.11%,可直接用做普通或特醫(yī)食品的原料或作為食品添加劑以降低食物GI及強(qiáng)化營養(yǎng)等[33]。

表2 脫淀粉殘?jiān)械闹饕M分(干重,%)Table 2 Main component in de-starch residue(dry weight,%)

圖5 脫淀粉殘?jiān)麱ig.5 De-starch residue

2.3 脫淀粉麥粒蛋白質(zhì)的水解

2.3.1 風(fēng)味蛋白酶水解結(jié)果 在pH為7.0,溫度50 ℃,酶添加量60 U/g的水解條件下,反應(yīng)22 h后水解液中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.33 g/100 mL(圖6),此時(shí)蛋白質(zhì)水解度為53.58%,全氮利用率達(dá)到80.29%,氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為63.12%。隨后反應(yīng)中氨基酸態(tài)氮含量雖仍有上升趨勢,但產(chǎn)生速度明顯放緩。這可能是由于溶液中游離氨基酸的增多對酶形成了產(chǎn)物抑制作用[34],或酶活力隨時(shí)間下降所致。繼續(xù)進(jìn)行低效率的反應(yīng)將導(dǎo)致過多的能源消耗,同時(shí)過長的反應(yīng)時(shí)間也增加了料液被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此,在水解22 h后終止反應(yīng),分離蛋白質(zhì)水解液,回收剩余殘?jiān)?/p>

圖6 風(fēng)味蛋白酶作用下溶液中氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢Fig.6 Trends of amino acid nitrogen content in solution during the hydrolysis of flavourzyme

2.3.2 蛋白質(zhì)水解液中游離氨基酸組成及分析 水解液中游離氨基酸組成及含量由表3所示。總游離氨基酸含量為2.693 mg/mL,其中亮氨酸及異亮氨酸含量較高,由于它們是造成產(chǎn)物抑制的主要氨基酸[35],因此這可能是18 h后氨基酸態(tài)氮產(chǎn)生速率降低的主要原因。小麥中較高含量的谷氨酸和脯氨酸[36]在風(fēng)味蛋白酶的水解下沒有被大量釋放,這與Choi等[17]水解面筋蛋白所得的結(jié)果一致。雖亮氨酸和異亮氨酸為具有苦味的疏水性氨基酸[37],且總含量多于水解液中呈鮮味及甜味的氨基酸,但水解液無明顯苦味。這可能因苦味氨基酸刺激閾值較高于鮮味及甜味氨基酸[38]。因此,此法回收得到的蛋白質(zhì)水解液可直接用做調(diào)味品添加劑或氨基酸補(bǔ)充劑等食品原料。

在水解液中未檢測到胱氨酸、賴氨酸及精氨酸。其中胱氨酸在小麥中的含量較低可能未被大量釋放,賴氨酸作為小麥中的第一限制性氨基酸且對熱較為敏感[39],同時(shí)它與精氨酸同為發(fā)生美拉德反應(yīng)速率較快的堿性氨基酸,這可能使其在較長時(shí)間的反應(yīng)過程中被破壞或消耗。

表3 脫淀粉小麥殘?jiān)鞍踪|(zhì)水解液游離氨基酸組成Table 3 Free amino acids composition in protein hydrolysate of de-starched wheat residue

2.3.3 脫淀粉及蛋白的殘?jiān)兄饕煞?水解后最終回收到43.55%的殘?jiān)?水分含量7.43%),其形態(tài)如圖7所示,主要成分由表4所示。殘?jiān)写掷w維含量可達(dá)80.09%、灰分含量為6.85%、脂肪含量為6.24%。此外,檢測到1.17%的總氮?dú)埩?可能為植物中存在的一些非蛋白質(zhì)氮[40]或少量難以被水解的蛋白質(zhì)。剩余殘?jiān)鼡碛休^高的膳食纖維含量,使其可以直接作為膳食纖維補(bǔ)充劑食用,或作為添加劑增強(qiáng)食物飽腹感以及加工成食品改良劑改善食品品質(zhì)等。

圖7 脫淀粉及蛋白后的殘?jiān)麱ig.7 De-starch and deproteinized residue

表4 脫淀粉及蛋白后的殘?jiān)兄饕M分(干重,%)Table 4 Main components in the de-starch and deproteinized residue(dry weight,%)

3 結(jié)論

本研究采用酶對完整小麥顆粒的宏量組分進(jìn)行分層水解并充分利用。結(jié)果表明,使用完整小麥顆粒作為底物進(jìn)行淀粉及蛋白質(zhì)分離是可行的,各階段產(chǎn)物的水解度及各組分的回收率均較高。做到了對原料宏量組分的全利用,無廢棄物及廢液產(chǎn)生,對環(huán)境友好。直至全部宏量組分被分離及回收,麥粒的完整性仍可以得到維持并呈堅(jiān)實(shí)的團(tuán)粒結(jié)構(gòu),這極大降低了分離難度并利于高純度產(chǎn)物的回收。分離得到的各組分不僅可以作為食品工業(yè)原料也可直接用于調(diào)味品、食品添加劑或特醫(yī)食品的開發(fā),具有良好的應(yīng)用價(jià)值及市場潛力。但最終剩余的殘?jiān)袡z測到少量脂肪殘留,這可能不利于產(chǎn)品的長期保存,未來將致力于對剩余脂肪的回收制定研究方案。