李文杰,王晨晨,顏朦朦,李慧冬,丁蕊艷,方麗萍,王蘭芝,侯運華,楊親正,*,陳子雷,4,*(.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院,生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東濟南 250353;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,山東濟南 25000;3.山東省食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)重點實驗室,山東濟南 25000;4.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟南 25004)

沙丁胺醇(SAL)為瘦肉精的一種,添加微量沙丁胺醇于牲畜飼料內(nèi),可以增加牲畜的瘦肉量、減少脂肪。然而其殘留會導(dǎo)致人體產(chǎn)生肌肉震顫、頭痛、心悸等不良癥狀,因此在歐盟及中國的動物飼料中已被禁用[1-6]。現(xiàn)有測定SAL的方法很多,如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[10-11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12-14]和串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)等[15-16]。然而這些方法大都需要昂貴的設(shè)備、熟練的技術(shù)人員和長時間的檢測分析。因此,開發(fā)簡單方便、快速靈敏、成本低廉、特異性高的分析方法已成為當(dāng)前的迫切需要。

表面等離子體共振技術(shù)(SPR)最初主要通過光學(xué)上的折射率變化應(yīng)用于監(jiān)測大分子間的相互作用,如考察抗原-抗體、受體-配體、適配體-識別物之間的親和力,隨后廣泛應(yīng)用到小分子檢測領(lǐng)域,其具有快速、無標(biāo)記、靈敏度高的優(yōu)點。SPR免疫傳感器應(yīng)用較為常見,其檢測方法主要為抑制法[17-21]。定量的抗體與芯片表面的抗原結(jié)合時在SPR傳感器上產(chǎn)生一個響應(yīng)值。將這一定量的抗體與待測物混合,待測物會消耗掉一定的抗體。當(dāng)混合物再與芯片表面作用時,通過計算SPR傳感器降低的響應(yīng)數(shù)值可以測算待測物的濃度。SPR免疫傳感器研制中,抗原/抗體在SPR芯片上的固定是非常關(guān)鍵的一步。硫醇分子是一種包含巰基和羧基的雙功能分子,通過巰基與金形成Au-S鍵,在金膜表面形成單分子層,有效減少蛋白質(zhì)在金片上的非特異性吸附。同時,羧基通過碳二亞胺法與抗原/抗體中的氨基共價偶聯(lián),從而將抗原/抗體結(jié)合在具有基底金膜的芯片表面。作為連接分子,硫醇中羧基基團的密度極大的影響著抗原/抗體結(jié)合,進而影響傳感器靈敏度和檢測性能。近年來,研究人員通過引入了混合硫醇單分子層SAMs來調(diào)節(jié)表面羧基官能團的濃度,來解決抗原/抗體結(jié)合中的空間位阻問題。Gobi等[22]通過不含羧基(1-癸硫醇)和含有羧基(11-巰基十一烷酸)相混合的模式來改變空間環(huán)境。Tsai等[23]也提出混合連接體這一策略,通過變換化合物的鏈長(己硫醇和16-巰基十六烷基酸),以期達(dá)到良好的空間微環(huán)境。然而,這些混合模式雖然降低羧基密度,但有效的硫醇連接分子無法均勻分布,仍會導(dǎo)致抗原/抗體聚集不均勻,從而影響測試的靈敏度。

基于以上科學(xué)問題,本文提出用雙巰基雙羧酸的DMSA來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的連接分子如單巰基單羧酸的MPA,以降低空間位阻及控制抗體的構(gòu)型和取向。通過SEM、AFM、電化學(xué)等表征手段考察通過不同硫醇單分子連接抗原修飾后的SPR芯片的形貌,并通過考察連接抗原后的SPR芯片與抗體間的識別效率確定SPR免疫傳感器的檢測性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPR裸芯片 北京中龍益誠科技公司;巰基丙酸(MPA)、二巰基丁二酸(DMSA) Sigma-Aldrich;沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、鹽酸馬布特羅、西馬特羅 BePure;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 生工生物工程(上海)公司;乙醇胺鹽酸鹽 阿拉丁;K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]·3H2O、KNO3、KCl、三水合乙酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(SAL-BSA)、SAL單克隆抗體(SAL-Ab) 深圳寶安康生物技術(shù)有限公司;豬肉 濟南華聯(lián)超市。

YC-SPR-A1表面等離子體共振儀 北京中龍益誠科技公司;CHI 760E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司;Cary 5000紫外-可見分光光度計 安捷倫;JSM-6700冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子;Nano Scope-IIIa原子力顯微鏡 美國DI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳感器芯片修飾及檢測原理 傳感器芯片修飾過程如圖1a所示,以MPA和DMSA作為自組裝單分子層分別通過碳二亞胺法將沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(salbutamol hydrochloridbovine serum albumin conjugate,SAL-BSA)固定在SPR裸芯片表面。抑制法檢測沙丁胺醇的原理如圖1b所示,首先將待測物與抗體混合,當(dāng)無沙丁胺醇時,抗體與芯片表面的抗原結(jié)合數(shù)量多,SPR的折射率強。當(dāng)存在沙丁胺醇時,沙丁胺醇會消耗掉其中的部分抗體,SPR的折射率減小。SPR 的折射率隨著沙丁胺醇濃度的不同而不同。

圖1 原理圖Fig.1 Schematic diagram注:a:以DMSA和MPA為SAMs的沙丁胺醇免疫傳感器芯片的修飾過程;b:抑制法測試沙丁胺醇。

1.2.2 不同連接單分子對SPR裸芯片的修飾 將SPR裸芯片分別置于0.5 mmol/L MPA和DMSA溶液中,反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,用乙醇和去離子水沖洗SPR芯片,并用氮氣干燥。

1.2.3 沙丁胺醇抗原的組裝 將1.2.2所制備SPR芯片置于400 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS的溶液中,室溫下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后,用去離子水沖洗SPR芯片,并用氮氣干燥。

用200 μL SAL-BSA溶液(1 mg/mL)涂覆上述處理的SPR芯片,并用乙醇胺溶液(1.0 mol/L,pH8.5)封閉未反應(yīng)的活性位點,最后用PBS溶液沖洗,得到MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA SPR芯片,在4 ℃下密封保存。

1.2.4 SAL-BSA修飾的SPR芯片活性考察 將不同濃度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)的SAL-Ab PBS溶液分別泵入SPR反應(yīng)池中與MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA的SPR芯片反應(yīng),流速為100 μL/min,再生溶液為100 mmol/L NaOH,再生液流速為400 μL/min,再生時間為30 s,并記錄表面等離子體共振儀的響應(yīng)值變化。

1.2.5 SAL-BSA修飾的SPR芯片表征

1.2.5.1 電化學(xué)表征 SPR芯片為工作電極,鉑(Pt)為對電極,Ag/AgCl為參比電極,在0.5～1 V電壓范圍內(nèi)掃描20圈,掃描速率為100 mVs-1。以鐵氰化鉀溶液(5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-,0.1 mol/L KCl和0.1 mol/L KNO3)為探針溶液,通過循環(huán)伏安曲線(CV)表征MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA芯片的電化學(xué)行為。

1.2.5.2 表面形貌表征 用SEM和AFM對MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA SPR芯片的表面形貌進行表征。SEM儀器參數(shù):二次電子像分辨率:1.0 nm(15 kV),2.2 nm(1 kV);背散射電子像分辨率:3 nm(15 kV,WD=8 mm);放大倍數(shù):50000;加速電壓:15 kV;電子束流:10-13～2×10-9A;數(shù)字圖像采集系統(tǒng)分辨率:1280×1024。AFM儀器參數(shù):空間分辨率:XY:0.2 nm,Z:0.1 nm;掃描分辨率:1024×1024 pixels;光譜分辨率:1 cm-1;納米化學(xué)像空間分辨率10 nm;激光波段:950～1900 cm-1,2700～4000 cm-1。

1.3 沙丁胺醇的測定

1.3.1 沙丁胺醇抗體濃度的選擇 將濃度為25 μg/mL的SAL-Ab和不同濃度的SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液(5、10、20、30、40、60、80、100、150 ng/mL)等體積混合,在37℃條件下溫育30 min,每個濃度重復(fù)測定3次,記錄SPR儀的響應(yīng)值變化。

1.3.2 實際樣品添加回收 本實驗所用豬肉用UPLC-MS/MS檢測無沙丁胺醇。將不同濃度(5,10,20 ng/mL)的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到1 g豬肉空白樣品中,靜置1 h,然后加入10 mL乙腈,均質(zhì)提取1 min,取1 mL上清液于5 mL離心管中,氮氣吹干,再用2 mL正己烷溶解,然后加入1 mL PBS溶液,充分振蕩均勻,并在85 ℃的水浴中溫育3 min,收集底部液體作為測試液體,待測液體通過0.22 μm濾膜過濾,取250 μL用于SPR免疫傳感器檢測,并重復(fù)制備每種濃度,每種添加濃度水平重復(fù)3次。

1.3.3 樣品的UPLC-MS/MS檢測 取1 mL 1.3.2制備的提取液于5 mL離心管中,氮氣吹干,再用2 mL正己烷溶解,然后加入1 mL甲醇溶液,充分振蕩均勻,取甲醇部分溶液上機檢測,并通過0.22 μm濾膜過濾,每種添加濃度水平重復(fù)3次。

1.3.4 UPLC-MS/MS檢測條件 色譜柱:EclipsePlus C18 RRHD(100×2.1 mm,1.8 μm,Agilent);柱溫:30 ℃;流動相條件:流動相A和流動相B分別為乙腈和0.1%甲酸-水溶液,比例為75∶25;洗脫程序:等度洗脫;流速:300 μL/min;進樣量:5 μL。離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:6 L/min;霧化器壓力:35 psi;毛細(xì)管電壓:4000 V;噴嘴壓力:500 V;去簇電壓:28 V;母離子(m/z):240.0;子離子(m/z):148.0*/222.0(*為定量離子);裂解電壓(V):100/100;碰撞能量(V):15/5。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以無待測SAL分子抑制的響應(yīng)值為B0,一定濃度的待測SAL分子抑制時的響應(yīng)值為B值,可計算抑制率:抑制率(%)=[(B0-B)/B0]×100,以SAL分子濃度C的對數(shù)log C為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo),用軟件進行曲線擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,每個樣品三次重復(fù)(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAL-BSA修飾的SPR芯片活性考察

為了研究MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA SPR芯片上抗原/抗體結(jié)合的結(jié)合效率,以相同濃度的SAL-Ab流經(jīng)SPR芯片表面產(chǎn)生的SPR信號響應(yīng)值的變化作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。在SAL-Ab的濃度相同時,芯片的折射率差值即SPR信號響應(yīng)值(ΔRU)越高說明芯片上SAL-Ab結(jié)合的數(shù)量越多。圖2為MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA芯片在相同SAL-Ab濃度下的SPR信號響應(yīng)情況,由圖2可知,當(dāng)SAL-Ab濃度同為75 μg/mL時,兩芯片可結(jié)合的SAL-Ab的濃度已經(jīng)飽和,此時MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA SPR芯片的折射率差值為58.8和115.6,這表明DMSA芯片在相同的實驗條件下可以結(jié)合更多的SAL-Ab。

圖2 在不同SAL-Ab濃度下芯片折射率變化 Fig.2 SPR index change of chip at different SAL-Ab concentrations注:a:MPA-SAL-BSA芯片SPR折射率變化情況;b:DMSA-SAL-BSA芯片的SPR折射率變化情況。

2.2 SAL-BSA修飾的SPR芯片表征

2.2.1 表面形貌表征 通過SEM和AFM對MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA芯片進行了形貌表征。SEM結(jié)果(圖3a～圖3c)表明,DMSA-SAL-BSA芯片的表面均勻程度優(yōu)于MPA-SAL-BSA芯片,這一結(jié)果進一步由AFM表征圖證明,如圖3d～圖3f所示,裸芯片(圖3d)的表面粗糙度Rq和Ra值分別為0.836、0.684 nm,MPA-SAL-BSA芯片(圖3e)的表面粗糙度Rq和Ra值分別為2.09、1.66 nm,而DMSA-SAL-BSA芯片(圖3f)的表面粗糙度Rq和Ra值分別為1.86、1.49 nm。因此,DMSA-SAL-BSA的芯片表面比MPA-SAL-BSA的更平整、更均勻。結(jié)合活性考察實驗結(jié)果,推測MPA芯片性能不佳是由于芯片上的SAL-BSA分布不均勻,與SAL-Ab結(jié)合的活性位點相互阻隔,從而導(dǎo)致SAL-BSA和SAL-Ab結(jié)合減少。因此,DMSA能夠改善抗原之間的空間微環(huán)境,進而提高抗原-抗體之間結(jié)合效率。

圖3 SPR芯片形貌圖Fig.3 SPR chip shape diagram注:a～c分別為裸芯片、MPA-SAL-BSA芯片、DMSA-SAL-BSA芯片的SEM圖;d～f分別為裸芯片、MPA-SAL-BSA芯片、DMSA-SAL-BSA芯片的AFM圖;SEM圖放大倍數(shù)50000×;AFM圖尺寸大小1×1 μm。

2.2.2 電化學(xué)表征 采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中比較了不同SPR芯片的循環(huán)伏安特征。如圖4所示,MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA芯片的氧化還原峰均小于裸芯片的氧化還原峰,表明SAL-BSA均修飾到芯片上,而MPA-SAL-BSA芯片的氧化還原峰大于DMSA-SAL-BSA芯片的氧化還原峰,說明MPA-SAL-BSA芯片表面的SAL-BSA不均勻,存在較大的間隙,提供了電子通道允許鐵氰化鉀離子通過溶液接觸到芯片表面,提高了氧化還原峰的響應(yīng)值,結(jié)合AFM結(jié)果,進一步說明DMSA-SAL-BSA芯片上的SAL-BSA均勻程度更高,充分利用了芯片表面的空間,阻礙了鐵氰化鉀離子與芯片表面接觸。因此,DMSA作為連接分子效果優(yōu)于傳統(tǒng)的MPA連接分子。

圖4 SPR芯片的CV圖Fig.4 CV of SPR chip 注:a:裸芯片CV圖;b:MPA-SAL-BSA芯片CV圖;c:DMSA-SAL-BSA芯片CV圖。

2.3 沙丁胺醇測定

2.3.1 最佳抗體濃度的選擇 在優(yōu)化的實驗條件下,考察了DMSA-SAL-BSA芯片檢測沙丁胺醇實驗中SAL-Ab的最佳濃度。從圖5可以看出,當(dāng)SAL濃度增大的情況下,SAL對SAL-Ab抑制率均增大。其中圖5a的線性方程為:y=-0.0086x2+1.7883x+18.524(R2=0.912),圖5b的線性方程為:y=-0.0054x2+1.471x-1.7194(R2=0.987),圖5c的線性方程為y=0.0006x2+0.1862x+2.5692(R2=0.961)抗體濃度為25 μg/mL時,檢測靈敏度最好?？紤]到實驗成本和檢測靈敏度,將SAL-Ab濃度25 μg/mL作為反應(yīng)濃度。數(shù)據(jù)點的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在4%以內(nèi),并在圖中顯示為誤差線(圖5b)。

圖5 三個不同SAL-Ab濃度在相同SPR條件下檢測SAL的抑制率變化與SAL濃度的關(guān)系Fig.5 Relationship between the change of inhibition rate of SAL and the concentration of SAL detected by three different SAL-Ab concentrations under the same SPR condition注:a:12.5 μg/mL;b:25 μg/mL;c:50 μg/mL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 在上述最佳條件下,將基于DMSA為連接體的SPR免疫傳感器應(yīng)用于SAL的檢測。如圖6所示以SAL分子濃度C的對數(shù)為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo),用軟件進行曲線擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得回歸方程y=0.008x2-1.95x+114.29(R2=0.982),將傳感器檢測沙丁胺醇能被測定的最低量作為LOQ,為5 ng/mL,IC50為39.1 ng/mL。

圖6 SPR免疫傳感器檢測SAL的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve for SAL detection by SPR immunosensor

2.3.3 豬肉樣品中SAL的檢測 為了驗證SPR方法的準(zhǔn)確性和可靠性,將豬肉用作樣品基質(zhì),添加濃度為5、10和20 μg/kg時的添加回收實驗(n=3),結(jié)果如表1所示,本文方法檢測SAL的回收率為94.9%～108.0%,RSD為1.30%～5.58%,與UPLC-MS/MS方法的結(jié)果相比,具有良好的一致性。因此,本文建立的方法適用于豬肉樣品中SAL的定量分析。

表1 豬肉樣品中沙丁胺醇的DMSA-SPR免疫傳感器和UPLC/MS/MS測定結(jié)果(n=3)Table 1 Results of salbutamol in pork samples by DMSA-SPR immunosensor and UPLC/MS/MS (n=3)

為了考察本文方法的識別特異性,選取了相同濃度(120 ng/mL)的萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、鹽酸馬布特羅和西馬特羅為SAL的結(jié)構(gòu)類似物。如圖7所示,SAL的抑制率明顯高于其他化合物,而且與混合物(120 ng/mL)的抑制率相差不大。因此,本文方法具有很好的特異識別性能。

圖7 DMSA-SPR免疫傳感器特異性分析Fig.7 Specific analysis of DMSA-SPR immunosensor

同時將所提出的競爭性DMSA-SPR免疫傳感器方法與先前報道的用于檢測沙丁胺醇的方法相比較,如表2所示,SPR傳感器的方法的檢測范圍與最低檢測值都低于表中所列方法,表明競爭性DMSA-SPR免疫傳感器方法是一種靈敏的方法,可用于食品中沙丁胺醇的檢測。

表2 沙丁胺醇檢測方法之間的比較Table 2 Comparison between salbutamol detection methods

3 結(jié)論

本實驗首次比較了DMSA和MPA作為SAMs的表面羧基官能團的濃度和排布,從實驗結(jié)果分析,具有雙巰基、雙羧酸特殊結(jié)構(gòu)的DMSA相較于單巰基、單羧酸的MPA傳統(tǒng)連接分子構(gòu)建的SPR芯片,SPR傳感器靈敏度更高。驗證了硫醇中羧基基團的密度和分布會影響SPR芯片表面抗原/抗體的結(jié)合。本文提出的通過使用DMSA作為SAMs來提高SPR免疫傳感器的檢測效率是一種有效的新思路,可應(yīng)用于其他小分子的方便快捷、高靈敏檢測。