郝俊光,陳婉玲,楊 麗,陳霜梅,梁振榮,銀 書,祁 岑,*(.北部灣大學(xué)欽州市特色果蔬發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 5350;.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司,廣西河池 546400)

羅城毛葡萄2016年獲國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志認(rèn)證,其富含氨基酸、維生素、硒、鍶、鋅、白藜蘆醇等營養(yǎng)物質(zhì),酸甜適中,具有良好的釀造加工性狀[1]。2019年毛葡萄的種植面積達(dá)8萬畝,產(chǎn)量1.5萬噸,已成為當(dāng)?shù)刂еa(chǎn)業(yè)[1],有利于貧困農(nóng)民脫貧和石漠化土壤改良。豐產(chǎn)后的毛葡萄暴露出了加工銷售能力弱、產(chǎn)業(yè)鏈單一的問題,因此需拓寬深加工能力、尋求多樣化應(yīng)用[1]。傳統(tǒng)的紅茶菌飲料是利用酵母菌、醋酸菌等天然共生菌群發(fā)酵茶糖水而制成的民間飲料,其源于中國,經(jīng)日本和俄羅斯向全球傳播[2-3],其保健作用備受各國人民的關(guān)注。目前人們對紅茶菌的發(fā)酵機(jī)理[4-6]、抗菌作用[7]、保健機(jī)理[8-9]、微生物組成[3,10-11]等進(jìn)行了系列的研究,從中鑒定出茶多酚、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、D-葡萄糖二酸-1,4內(nèi)酯等有益成分[4-5,9],證明了其具有抗癌[7]、護(hù)肝[8-9]、抗炎癥[10-12]、防治糖尿病[12-13]等功效。當(dāng)前紅茶菌產(chǎn)品不再局限于茶葉發(fā)酵飲料,已擴(kuò)展至對咖啡[14]、谷物[15-16]、水果[17-19]等的開發(fā)應(yīng)用,但尚未應(yīng)用到毛葡萄,這為毛葡萄的深加工提供了新思路。

紅茶菌類產(chǎn)品是酸性的,主要有機(jī)酸是葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、乙酸等[20-22]。相關(guān)研究多用pH或總酸表征其酸性特征[22-23],即便涉及有機(jī)酸也僅限乙酸、琥珀酸、檸檬酸、葡萄糖酸等[17,21-22]，檢測有機(jī)酸的種類偏少,不能用于多種有機(jī)酸組成變化的同時檢測。建立包括葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、抗壞血酸等多種有機(jī)酸的同時檢測技術(shù),有益于紅茶菌類產(chǎn)品的開發(fā)和品控。有機(jī)酸的測定方法主要包括氣相法、液相法(紫外法、示差法、質(zhì)譜法)、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法,其中液相紫外法和離子色譜法較常用[24],已知離子色譜法不能將氟離子跟紅茶菌最主要的有機(jī)酸-葡萄糖酸有效分離[25]。GB/T 15038-2006的實(shí)施,引發(fā)了學(xué)者利用不同反相色譜柱對不同樣品有機(jī)酸檢測的方法開發(fā),現(xiàn)已形成了多種有機(jī)酸檢測的專用方法,但未見同時檢測紅茶菌特征有機(jī)酸包括葡萄糖酸、葡萄糖醛酸的在內(nèi)的多種有機(jī)酸的檢測方法[24,26-27]。Waters Atlantis? T3色譜柱適合保留和分離性強(qiáng)的極性化合物,其在有機(jī)酸方法開發(fā)中的應(yīng)用尚未見報道。為明確紅茶菌發(fā)酵毛葡萄多種有機(jī)酸的同時變化,擬采用T3色譜柱開發(fā)包括葡萄糖酸在內(nèi)的13種有機(jī)酸的檢測方法,來分析利用紅茶菌發(fā)酵毛葡萄生產(chǎn)酸性功能軟飲品的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛葡萄 2019年市售羅城產(chǎn)毛葡萄,糖度15.5 Bx°,色澤紫黑,飽滿,無霉?fàn)€、損傷,購買后在4 ℃冰箱貯存;白糖 市售甘蔗白糖;紅茶菌 好氧菌股份有限公司;0.22 μm SLGP 033RB針頭濾膜 美國Millipore公司;乙腈、磷酸、KH2PO4、L-蘋果酸、乙酸、L-乳酸、L-酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸、草酸、富馬酸、奎尼酸、葡萄糖醛酸、丙酮酸、檸檬酸鈉 色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖酸溶液 純度51%,上海麥克林生化科技有限公司。

Waters Alliance 2695HPLC分離單元、2996 PDA檢測器 美國Waters公司;UV-1800紫外可見光分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;INNOVA43R落地式低溫?fù)u床 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;WYT-J手持式折光儀 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司;H1850高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;HE53水分測定儀、ME204E電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Cascada I實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng) 美國PALL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅茶菌發(fā)酵毛葡萄

1.2.1.1 毛葡萄發(fā)酵工藝流程 毛葡萄→洗凈除?！Q量→破碎→加入糖水→混勻→加入菌膜→封蓋→控溫發(fā)酵

1.2.1.2 毛葡萄發(fā)酵操作要點(diǎn) 破碎:將毛葡萄用清水漂洗,除去壞果、梗枝,瀝干表面水分。用經(jīng)400 mg/L焦亞硫酸鈉清洗過的對輥粉碎機(jī)搗碎。

糖水配制:25 g/100 mL糖水裝于三角瓶中,121 ℃滅菌15 min。

接種:將400 g帶皮葡萄漿倒入已滅菌的2 L三角瓶中,加入400 mL糖水、50 g紅茶菌膜,混勻,使發(fā)酵液糖度達(dá)到18 Bx°。

發(fā)酵:瓶口用8層醫(yī)用紗布覆蓋、扎緊,28 ℃發(fā)酵。

取樣與檢測:在18個發(fā)酵瓶中進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),分別在3、5、7、9、14、17 d打開三瓶進(jìn)行檢測。每個樣品的有機(jī)酸檢測三次,結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

1.2.2 有機(jī)酸檢測

1.2.2.1 色譜條件的優(yōu)化和有機(jī)酸的定性 配制草酸50 mg/L、葡萄糖醛酸50 mg/L、酒石酸400 mg/L、葡萄糖醛酸2500 mg/L、奎尼酸75 mg/L、丙酮酸75 mg/L、蘋果酸200 mg/L、抗壞血酸10 mg/L、乳酸200 mg/L、乙酸2000 mg/L、檸檬酸100 mg/L、富馬酸4 mg/L、琥珀酸200 mg/L的單標(biāo),用于不同有機(jī)酸的保留時間、峰形和強(qiáng)弱的確定。上述單標(biāo)溶液等體積混合后用于色譜條件的優(yōu)化,色譜峰的辨識基于單標(biāo)所獲取的峰形、強(qiáng)度和出峰順序)。

色譜條件的優(yōu)化:首先驗(yàn)證了210 nm測定有機(jī)酸的適應(yīng)性,接著在其它條件固定的前提下,分別進(jìn)行了柱溫(25、30、35 ℃)、流動相KH2PO4的濃度(0.01、0.02、0.04 mol/L)、流動相pH(2.4、2.6、2.8、3.0)、流速(0.4、0.45、0.5、0.55 mL/min)的單因素比對實(shí)驗(yàn),從而得到優(yōu)化的色譜條件。在優(yōu)化的條件下確定每個有機(jī)酸的保留時間,最終完成有機(jī)酸的定性。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與方法評價 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:稱取各種標(biāo)準(zhǔn)品適量,用KH2PO4緩沖液溶解并定容至100 mL,得到濃度為葡萄糖醛酸 0.8 mg/mL(用于葡萄糖醛酸和草酸共流出峰的相對定量)、酒石酸3.2 mg/mL、葡萄糖酸20 mg/mL、奎尼酸0.6 mg/mL、丙酮酸0.6 mg/mL、蘋果酸1.6 mg/mL、抗壞血酸0.08 mg/mL、乳酸1.6 mg/mL、乙酸20 mg/mL、檸檬酸1.6 mg/mL、富馬酸0.024 mg/mL、琥珀酸1.6 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃保存。

在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行有機(jī)酸標(biāo)樣的定量檢測。色譜柱:Waters Atlantis?T3色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:KH2PO4緩沖液(0.02 mol/L,pH2.6);等度洗脫;流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:210 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:用KH2PO4緩沖液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,共六個梯度。在優(yōu)化的條件下對六個梯度進(jìn)行檢測,將峰面積(y)和濃度(x)進(jìn)行強(qiáng)制過原點(diǎn)的線性擬合,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

定量方法的方法學(xué)評估:對最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋檢測,取信噪比S/N 3和10時對應(yīng)分析物的濃度作為檢出限和定量限。向毛葡萄7 d發(fā)酵液的5倍稀釋液中加入等體積的梯度4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,平行測定6次,計(jì)算出相應(yīng)組分的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2.3 樣品的檢測 紅茶菌發(fā)酵毛葡萄樣品以8000 r/min離心15 min,用去離子水稀釋3～5倍,經(jīng)0.22 μm針頭微孔濾膜過濾至樣品瓶。在優(yōu)化的色譜條件下上機(jī)檢測,用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 利用二極管陣列檢測器PDA對草酸、葡萄糖醛酸等13種目標(biāo)分析物在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)各分析物在210 nm均有較大的吸收,且流動相干擾較小,故采用210 nm作為檢測波長。

2.1.2 檢測溫度的選擇 在流動相KH2PO4緩沖液(0.02 mol/L,pH2.6)、流速0.4 mL/min的前提下,對比了25、30、35 ℃檢測溫度對有機(jī)酸分離度的影響,結(jié)果見圖1?？梢园l(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,有機(jī)酸的保留時間有所縮短。25 ℃條件下,檸檬酸和富馬酸不能有效分離。35 ℃條件下L-酒石酸、葡萄糖酸的分離度較30 ℃差,因此,選擇30 ℃為優(yōu)化的檢測溫度。草酸/葡萄糖醛酸在所有優(yōu)化過程中均完全重合,故在下述優(yōu)化描述中不再重復(fù)提及。

圖1 13種有機(jī)酸標(biāo)樣在不同檢測溫度下的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 13 organic acid standards under different column temperature注:1:草酸/葡萄糖醛酸;2:L-酒石酸;3:葡萄糖酸;4:奎尼酸;5:丙酮酸;6:L-蘋果酸;7:抗壞血酸;8:L-乳酸;9:乙酸;10:檸檬酸;11:富馬酸;12:琥珀酸;圖2～圖5同。

2.1.3 流動相濃度的選擇 用H3PO4滴定,調(diào)整0.01、0.02、0.04 mol/L的KH2PO4緩沖液的pH到2.6。在流速0.4 mL/min 30 ℃的檢測溫度下,比對三個濃度梯度對有機(jī)酸分離效果的影響,結(jié)果見圖2。三個梯度的分離度差異不大,考慮到緩沖溶液的濃度高有利于有機(jī)酸分子態(tài)的穩(wěn)定存在以及高濃度的鹽溶液會對泵和柱子的壽命會產(chǎn)生影響,選取0.02 mol/L的KH2PO4溶液做流動相。

圖2 13種有機(jī)酸標(biāo)樣在不同濃度緩沖鹽作為流動相的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of 13 organic acid standards with different concentration of buffer solutions

2.1.4 流動相pH的選擇 用H3PO4滴定調(diào)整0.02 mol/L的KH2PO4緩沖液的pH分別達(dá)到2.4、2.6、2.8、3.0,在流速0.4 mL/min、30 ℃的檢測溫度的前提下,比對四個不同pH緩沖液對有機(jī)酸分離效果的影響,結(jié)果見圖3。流動相pH增加時各有機(jī)酸的保留時間會縮短,檸檬酸和富馬酸在pH2.8時不能有效分離,在pH3.0時融合、峰形異常。pH2.4、2.6均有較好的分離效果,考慮到低pH流動相對柱子壽命的潛在影響,選擇pH2.6的KH2PO4溶液做流動相。

圖3 13種有機(jī)酸標(biāo)樣在不同pH緩沖鹽作為流動相的HPLC色譜圖Fig.3 Chromatograms of 13 organic acid standards with different mobile phase pH

2.1.5 流速的選擇 在流動相KH2PO4緩沖液(0.02 mol/L,pH2.6)、30 ℃檢測溫度的條件下,對比了流速0.40、0.45、0.50、0.55 mL/min對有機(jī)酸分離情況的影響,結(jié)果見圖4。發(fā)現(xiàn)隨著流速的增加,有機(jī)酸的保留時間縮短。相對而言,0.40 mL/min條件下各有機(jī)酸的分離度均較好,尤其是 L-酒石酸、葡萄糖酸的分離效果優(yōu)于其它流速,所以選擇流速0.40 mL/min。

圖4 13種有機(jī)酸標(biāo)樣在不同流速下的HPLC色譜圖Fig.4 Chromatograms of 13 organic acid standards with different flow velocity of mobile phase

2.2 有機(jī)酸的定性

在優(yōu)化的條件下確定每個有機(jī)酸的保留時間,實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的定性。圖5為優(yōu)化條件下13種有機(jī)酸的色譜圖,可以看出除草酸和葡萄糖醛酸共流出外,其它有機(jī)酸標(biāo)樣均有較好分離。

圖5 優(yōu)化條件下13種混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖Fig.5 Chromatograms of 13 organic acid standards under optimum conditions

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及方法的評價

在上述最優(yōu)條件下,將紅茶菌發(fā)酵毛葡萄7 d發(fā)酵液稀釋5倍后進(jìn)行檢測,色譜圖見圖6?？梢园l(fā)現(xiàn)目標(biāo)物周圍無明顯的干擾,說明方法適合樣品檢測。由于本研究色譜條件下葡萄糖醛酸和草酸完全重合,只能采用葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線對共流出峰進(jìn)行相對定量。目前有采用液相紫外和示差法對葡萄糖醛酸含量絕對定量的報道[4,17-18],但其未同時檢測草酸的情況,不能排除在這些文獻(xiàn)報道的色譜條件下存在草酸對葡萄糖醛酸數(shù)據(jù)干擾的可能性。相對而言,液相質(zhì)譜報道的紅茶菌葡萄糖醛酸數(shù)據(jù)更為可信,因?yàn)闄z測機(jī)理決定著其檢測不受草酸干擾[28]。

圖6 優(yōu)化條件下紅茶菌毛葡萄發(fā)酵稀釋液的HPLC譜圖Fig.6 Chromatogram of organic acids in fermentative broth ofVitis quinnquangularis Rehd. by the kombucha consortium under optimum HPLC conditions

在優(yōu)化的條件下對6個混合標(biāo)準(zhǔn)梯度進(jìn)行檢測,將峰面積(y)和濃度(x)進(jìn)行強(qiáng)制過原點(diǎn)的線性擬合,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行方法評價。標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性范圍與R2、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率、RSD等結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,線性范圍較寬,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)分布范圍0.990～0.996,線性良好,適合紅茶菌稀釋3～5倍后進(jìn)行檢測;檢出限范圍0.024～0.080 mg/L,定量限范圍0.080～4.789 mg/L,加標(biāo)回收率92.68～107.35%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%,說明該方法精密度良好,準(zhǔn)確度高,可滿足實(shí)際樣品的檢測。

表1 有機(jī)酸組分的保留時間、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Retention time,linear range,regression equation,correlation coefficient,limit of detection,limit of quantitation,recovery,RSD of organic acids by HPLC

2.4 紅茶菌發(fā)酵過程有機(jī)酸的變化

紅茶菌發(fā)酵毛葡萄漿的有機(jī)酸變化見圖7。葡萄糖酸、乙酸是主要的有機(jī)酸,在17 d的發(fā)酵液中濃度分別是138795和37841 mg/L,占所測有機(jī)酸總量的75.03%和10.46%。在17 d發(fā)酵液中有機(jī)酸濃度由大到小的順序依次是:葡萄糖酸>乙酸>L-酒石酸>奎尼酸>L-蘋果酸>L-乳酸>丙酮酸>琥珀酸>檸檬酸>草酸/葡萄糖醛酸>抗壞血酸>富馬酸。

圖7 毛葡萄紅茶菌發(fā)酵過程13種有機(jī)酸的變化情況Fig.7 The changes of 13 organic acids in fermentative broth of Vitis quinnquangularis Rehd. during the process fermented by the kombucha consortium

從發(fā)酵過程的變化趨勢上看,除葡萄糖酸、蘋果酸、乙酸一直增加外,其它組分均呈現(xiàn)先升后降的趨勢且各自出現(xiàn)濃度峰值的時間不同。葡萄糖醛酸/草酸共流出物相對含量的峰值出現(xiàn)最早,而其下降或許與草酸容易形成鹽沉淀有關(guān)。葡萄糖醛酸因其解毒功能而備受人們重視[18,29-30],但葡萄糖醛酸/草酸共流出物相對含量在17 d的發(fā)酵液中含量僅為46.1 mg/L,再次印證了其在紅茶菌發(fā)酵液中含量不高。酒石酸在葡萄汁中初始含量相對較高,發(fā)酵過程未呈現(xiàn)大幅增加,跟葡萄酒發(fā)酵過程的表現(xiàn)類似[24]?？崴崾亲匀唤缙毡榇嬖诘亩嗔u基化合物[31],在發(fā)酵過程增加明顯,與酚酸的報道趨勢一致[14,17]。乳酸由紅茶菌菌群的乳酸菌代謝生成[22,28],但它不是紅茶菌的主要有機(jī)酸?？箟难嵩谇?4 d的發(fā)酵過程中一直增加,在17 d時有所下降,其發(fā)酵過程含量的提升與文獻(xiàn)報道一致[2]。琥珀酸在發(fā)酵過程中緩慢增加后緩慢降低,檸檬酸的變化不顯著,而富馬酸含量極少。與初始發(fā)酵液對比,僅17 d草酸/葡萄糖醛酸共流出物的濃度下降,降幅為0.36倍;而其它有機(jī)酸均增加,增幅由大到小依次是乙酸(945.1倍)、奎尼酸(6.8倍)、葡萄糖酸(5.2倍)、L-乳酸(2.1倍)、L-蘋果酸(1.7倍)、丙酮酸(1.5倍)、琥珀酸(1.1倍)、抗壞血酸(0.85倍)、檸檬酸(0.65倍)、富馬酸(0.33倍)。葡萄糖酸和乙酸是紅茶菌的主要有機(jī)酸,是醋酸菌分別作用葡萄糖和乙醇所生成的產(chǎn)物[32],它們的濃度和比例決定著發(fā)酵液的酸度和酸感。葡萄糖酸的酸味純正柔和[30]、酸度約為檸檬酸和乳酸的1/3～1/4[33],預(yù)示著利用紅茶菌發(fā)酵羅城毛葡萄制作酸性功能飲料將較葡萄醋的口感更佳。

3 結(jié)論

通過對檢測波長、流動相pH、流動相濃度、柱溫和流速進(jìn)行優(yōu)化,建立了高效液相色譜同時測定毛葡萄紅茶菌發(fā)酵液中13種有機(jī)酸的分析方法。在優(yōu)化的條件下,葡萄糖醛酸和草酸完全重合(只能用葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量),而葡萄糖酸、奎尼酸、抗壞血酸等其它11種酸組分在樣品中均能有效分離。該方法線性寬、檢出限低、回收率高、精密度好,不僅適用于毛葡萄紅茶菌發(fā)酵液組分的檢測,也已在火龍果、百香果、桑葚以及米酒發(fā)酵液的有機(jī)酸檢測中得到成功應(yīng)用。

通過對毛葡萄紅茶菌的發(fā)酵過程進(jìn)行跟蹤,明確了各有機(jī)酸的協(xié)同變化規(guī)律。葡萄糖酸、乙酸是主要的有機(jī)酸,分別占所測有機(jī)酸總量的75.03%和10.46%。有機(jī)酸濃度由大到小的順序依次是:葡萄糖酸>乙酸>L-酒石酸>奎尼酸>L-蘋果酸>L-乳酸>丙酮酸>琥珀酸>檸檬酸>草酸/葡萄糖醛酸>抗壞血酸>富馬酸。與初始發(fā)酵液對比,僅17 d草酸/葡萄糖醛酸共流出物的濃度下降,其它有機(jī)酸均增加,且乙酸、奎尼酸、葡萄糖酸、L-乳酸的增幅在2倍以上。蘋果酸、葡萄糖酸、乙酸在發(fā)酵過程中一直增加,而其它酸類均呈現(xiàn)先升后降的趨勢、各自出現(xiàn)濃度峰值的時間也不同。鑒于葡萄糖酸的純正柔和口感、弱酸度,意味著用紅茶菌發(fā)酵羅城毛葡萄制作酸性功能飲料將比葡萄醋的口感更佳,這為羅城毛葡萄深加工提供了一條新思路。