劉葉倩，李弘，龔?qiáng)?，陳春茗，馬丹鳳，劉林，王志琪，曾勇，王宇紅，任衛(wèi)瓊

復(fù)方七芍降壓片對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

劉葉倩1，李弘1，龔?qiáng)?，陳春茗1，馬丹鳳2，劉林1，王志琪3，曾勇1，王宇紅4，任衛(wèi)瓊1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208

觀察復(fù)方七芍降壓片對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子與P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，探討其治療高血壓的機(jī)制。采用內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系，利用炎癥因子TNF-α建立高血壓炎癥微環(huán)境。將共培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、空白血清組、MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組。MRS2578組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組加入10 μmol/L MRS2578。正常組和模型組加入等量培養(yǎng)液，余各組加入10%藥物血清及空白血清。采用倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形態(tài)；采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10水平；采用免疫熒光、Western blot、RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的表達(dá)。與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞輪廓不清晰，折光性降低，漂浮的死細(xì)胞團(tuán)塊增多；IL-1β含量顯著增加，IL-10含量顯著減少（＜0.01）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強(qiáng)度、灰度值、mRNA水平明顯升高（＜0.01）。與模型組比較，復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常；IL-1β水平明顯降低（＜0.05）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強(qiáng)度、灰度值、mRNA水平明顯降低（＜0.01）。復(fù)方七芍降壓片可明顯調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮炎癥導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞損傷，維持其正常功能，其機(jī)制可能與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體及其下游信號(hào)通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)，改善炎癥反應(yīng)有關(guān)。

復(fù)方七芍降壓片；內(nèi)皮細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞；P2Y6-MEK1/2-ERK1/2；炎癥反應(yīng)；血管重塑；大鼠

血管重塑是高血壓病最顯著的病理性特征，是引發(fā)其他靶器官損傷的共同病理基礎(chǔ)，也是高血壓致死的重要危險(xiǎn)因素。高血壓作為一種慢性炎癥性疾病，炎癥在高血壓的發(fā)展進(jìn)程及血管重塑的形成中扮演著極其重要的角色。嘌呤受體P2Y6是一種炎性誘導(dǎo)性蛋白，參與調(diào)控血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)[1]。酪氨酸激酶受體1/2（MEK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶1/2（ERK1/2）作為促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的重要組成部分，在細(xì)胞增殖與分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。有研究表明，炎性受體P2Y6廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中[4]，其激活后可上調(diào)MEK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2通路，促進(jìn)炎癥因子釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5]。炎癥損傷內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮功能受損，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，引起平滑肌細(xì)胞損傷，出現(xiàn)增殖、肥大、遷移、紊亂現(xiàn)象，導(dǎo)致血管重塑。這些證據(jù)表明，P2Y6受體介導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)可能是調(diào)控血管重塑的重要機(jī)制之一。

復(fù)方七芍降壓片具有養(yǎng)陰柔肝、化瘀熄風(fēng)功效，為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療肝腎陰虛、陰虛陽(yáng)亢型高血壓的經(jīng)驗(yàn)方。本課題組前期研究表明，該方可通過(guò)逆轉(zhuǎn)血管重塑，發(fā)揮良好的降壓作用[6]，但其作用機(jī)制是否與內(nèi)皮細(xì)胞中P2Y6受體相關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系為研究對(duì)象，探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體相關(guān)信號(hào)通路活化狀態(tài)與血管平滑肌細(xì)胞損傷的相關(guān)性，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

雄性SD大鼠15只，SPF級(jí)，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)43004700048755，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度22～25 ℃、濕度50%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。原代大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株（CP-R075）、平滑肌細(xì)胞株（CP-R076），Procell公司。

1.2 藥物

復(fù)方七芍降壓片（三七6 g、白芍10 g、丹參12 g、天麻10 g、葛根10 g、桑寄生10 g、杜仲10 g、甘草3 g等），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，批號(hào)20181026，規(guī)格0.46 g/片，人臨床日用量為12片，相當(dāng)于原藥材97 g，蒸餾水稀釋備用；厄貝沙坦片，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司，批號(hào)17122111，規(guī)格75 mg/片，成人臨床日用量為300 mg，蒸餾水稀釋備用。MRS2578，美國(guó)Selleck公司，批號(hào)S285501。

1.3 主要試劑與儀器

MEK1/2（00045687）一抗，Proteintech試劑公司；P2Y6（GR209076-11）、ERK1/2（AH10223489）、β-actin內(nèi)參抗體（AH11286487）、山羊抗兔HRP二抗（AH11279138），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；1L-1β（20190305）、IL-10（20190305）ELISA試劑盒，上海晶天生物科技有限公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（WH01111906SP），Procell公司。mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD），MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃），K30型干式恒溫器（杭州爽盛儀器），Centrifuge 5424 R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），HI1210型水浴鍋（Leica），BCD-196TMZL型冰箱（青島Haier），Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析（上海天能），ULUPURE型優(yōu)普特實(shí)驗(yàn)室超純水（法國(guó)Millipore）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將原代內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分別置于37 ℃、5%CO2專(zhuān)用培養(yǎng)液中培養(yǎng)，隔日換液，0.25%胰酶消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～5×106個(gè)/mL，按條件培養(yǎng)基不同分別轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)瓶，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 共培養(yǎng)體系建立

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～5×106個(gè)/mL；將內(nèi)皮細(xì)胞接種至Transwell小室孔板底部，平滑肌細(xì)胞接種至Transwell小室內(nèi)側(cè)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)1～2 d，即可成功構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系[4]。

2.3 分組和給藥

共培養(yǎng)體系成功建立后，加入10 ng/mL TNF-α干預(yù)24 h，構(gòu)建模擬高血壓炎癥微環(huán)境。并隨機(jī)分為正常組（內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞）、模型組（內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子）、空白血清組（內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子＋空白血清）、MRS2578組（沉默內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子）、厄貝沙坦藥物血清組（內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子＋厄貝沙坦片血清）、復(fù)方七芍藥物血清組（內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子＋復(fù)方七芍降壓片血清）和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組（沉默內(nèi)皮細(xì)胞＋平滑肌細(xì)胞＋炎癥因子＋復(fù)方七芍降壓片血清）。MRS2578組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組加入10 μmol/L MRS2578。正常組和模型組加入等量培養(yǎng)液，其余各組加入10%藥物血清及空白血清。取實(shí)驗(yàn)大鼠15只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為厄貝沙坦組、復(fù)方七芍降壓片組和空白組，每組5只，分別灌胃給予臨床等效劑量3倍的厄貝沙坦片（0.081 g/kg）、復(fù)方七芍降壓片（1.50 g/kg）和等體積蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，每日2次，連續(xù)3 d。末次給藥后2 h，腹主動(dòng)脈取血，4500 r/min離心10 min，取上清液，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得厄貝沙坦片血清、復(fù)方七芍降壓片血清及空白血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

造模干預(yù)及藥物處理24 h后，倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。

2.5 細(xì)胞上清液炎癥因子白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-10水平檢測(cè)

造模干預(yù)及藥物處理24 h后，收集細(xì)胞上清液，3000 r/min離心15 min，取上清液，ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-10水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.6 免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)

取培養(yǎng)好的細(xì)胞，移去孔內(nèi)液體，冷PBS潤(rùn)洗2次，4%多聚甲醛固定30 min、0.25%Triton-10作用15 min及5%BSA封閉10 min后，分別加入兔抗大鼠P2Y6、MEK1/2、ERK1/2一抗稀釋液（體積比均為1∶100），4 ℃避光孵育過(guò)夜，棄液，冷PBS潤(rùn)洗4次。加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋液（體積比均為1∶400），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷PBS潤(rùn)洗4次。加入DAPI工作液，室溫避光孵育15 min，棄液，冷PBS潤(rùn)洗4次，最后進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照，并以平均熒光強(qiáng)度值反映各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)

從RIPA細(xì)胞裂解物中提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法檢測(cè)蛋白含量，按4∶1比例加入5×SDS上樣緩沖液，配制10%SDS-PAGE膠電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上（90 V，50 min），封閉液（5%脫脂奶粉）水平搖床封閉2 h，加入P2Y6、MEK1/2、ERK1/2抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，將孵育好一抗的PVDF膜用PBST洗滌3次，5 min/次。二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌后，ECL發(fā)光、顯影。TANON GIS軟件讀取各目的蛋白的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達(dá)

收集各組內(nèi)皮細(xì)胞樣本，PBS漂洗3次，加入適量Trizol，充分混勻后，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液置于離心管；再移取200 μL氯仿溶液加入上清液，混勻后，渦旋15 s，離心，取上清液加入等體積異丙醇溶液，離心后留取離心管底部RNA沉淀，加入75%乙醇，離心，丟棄上清液，RNA沉淀干燥后加入20 μL RNase-free溶液，得各組mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp P2Y6F：CGGTCATCGGCTTCTTGCTTCC120 R：CCTTGCTGCGACGCTCTTGG MEK1/2F：CAAGAAGAAGCCGACGCCCATC124 R：GTCCAGCTCCAGCTCCTCCAG ERK1/2F：GGGAGGTGGAGGTGGTGAAGG100 R：GCTGAGCTGACCATGCCGTAC β-actinF：CCCAGGCATTGCTGACAGGATG144 R：TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 復(fù)方七芍降壓片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形態(tài)的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞輪廓不清晰，折光性降低，漂浮的死細(xì)胞團(tuán)塊增多；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)量不同程度增加，且內(nèi)皮細(xì)胞呈典型鋪路石樣，平滑肌細(xì)胞梭形形態(tài)恢復(fù)，折光性增強(qiáng)，漂浮的死細(xì)胞顯著減少，其中尤以復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組改善作用最明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

4.2 復(fù)方七芍降壓片對(duì)細(xì)胞上清液炎癥因子白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-10水平的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組細(xì)胞上清液IL-1β水平顯著升高（＜0.01），IL-10水平明顯降低（＜0.01），表明TNF-α干預(yù)構(gòu)建炎癥微環(huán)境后造成促炎因子IL-1β分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組IL-1β水平明顯降低（＜0.05，＜0.01），MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組細(xì)胞上清液IL-10水平明顯升高（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組IL-1β水平明顯降低（＜0.05），IL-10水平升高（＞0.05）。提示MRS2578和復(fù)方七芍降壓片藥物血清均能顯著抑制炎癥微環(huán)境損傷后細(xì)胞炎癥因子IL-1β分泌增加及IL-10分泌減少，且兩者合用效果更佳。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R.MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復(fù)方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MRS2578組比較，#P＜0.05

4.3 復(fù)方七芍降壓片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強(qiáng)度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2熒光強(qiáng)度明顯降低，MRS2578組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2熒光強(qiáng)度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2熒光強(qiáng)度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。提示復(fù)方七芍降壓片藥物血清在一定程度上能抑制炎癥因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的高表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖4～圖7。

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞MEK1/2蛋白表達(dá)均有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），MRS2578組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞MEK1/2灰度值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、ERK1/2蛋白表達(dá)均有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），MEK1/2蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）。表明復(fù)方七芍降壓片藥物血清對(duì)炎癥因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有不同程度的保護(hù)作用，且與MRS2578合用時(shí)效果更佳。結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復(fù)方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復(fù)方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復(fù)方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與MRS2578組比較，##P＜0.01

4.4 復(fù)方七芍降壓片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，MRS2578組、厄貝沙坦藥物血清組、復(fù)方七芍藥物血清組和MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與MRS2578組比較，MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6、ERK1/2 mRNA表達(dá)降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），MEK1/2 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。表明復(fù)方七芍降壓片在一定程度上能抑制P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的mRNA表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖10。

注：C.正常組；M.模型組；Q.空白血清組；R. MRS2578組；Y.厄貝沙坦藥物血清組；Z.復(fù)方七芍藥物血清組；ZR. MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組；與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與MRS2578組比較，##P＜0.01

5 討論

高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇。其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以虛證居多，責(zé)之肝腎。腎陰虧虛，肝失濡養(yǎng)，虛火上擾，水不涵木，陰不維陽(yáng)，陰虛陽(yáng)亢，肝風(fēng)擾動(dòng)，發(fā)為眩暈。故治以養(yǎng)陰柔肝、化瘀熄風(fēng)之法。復(fù)方七芍降壓片以三七、白芍活血化瘀、養(yǎng)陰柔肝，桑寄生、杜仲補(bǔ)腎養(yǎng)肝，丹參、天麻、地龍活血熄風(fēng)通絡(luò)，蘿芙木、葛根清熱生津，炒香附疏肝理氣，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏養(yǎng)陰柔肝、化瘀熄風(fēng)之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，三七、丹參具有舒張血管、降低外周阻力、改善微循環(huán)作用；天麻、地龍具有降低血漿中血管緊張素含量、減少血管活性物質(zhì)分泌、調(diào)控血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能；白芍、桑寄生、杜仲、蘿芙木、葛根可緩解平滑肌痙攣，改善血管內(nèi)皮依賴性舒縮失衡，防治血管重構(gòu)[7-9]。

平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，共同維持血管正常功能，與高血壓血管重塑密切相關(guān)。平滑肌細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞之一，兩者以隙縫連接方式相互調(diào)節(jié)[10]，其中平滑肌細(xì)胞受損、增殖是導(dǎo)致血管重塑的重要病理過(guò)程[11]；而內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子刺激平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，致使細(xì)胞基質(zhì)中膠原纖維增多，參與心血管疾病的血管重塑[5]。正常情況下血管平滑肌處于一種靜息狀態(tài)，當(dāng)炎癥因子、氧自由基等刺激因子導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損時(shí)，容易打破這種狀態(tài)，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)紊亂，引起血管平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變[12]。郭庶等[13]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮功能損傷時(shí)會(huì)引起TNF-α、IL-6等炎癥因子水平上調(diào)，激活平滑肌細(xì)胞中黏結(jié)蛋白聚糖4，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管重塑。此外，Ma等[14]認(rèn)為，TNF-α通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮因子的表達(dá)加重血管重塑。以上研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷可引起炎癥因子分泌增加，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)損傷、結(jié)構(gòu)改變、功能障礙、增殖、遷移等病理改變，誘發(fā)血管重塑。因此，研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞對(duì)平滑肌細(xì)胞的影響，對(duì)逆轉(zhuǎn)血管重塑具有重要意義。內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)模型與體內(nèi)細(xì)胞間結(jié)構(gòu)最為相似，有利于維持細(xì)胞間形態(tài)和功能的穩(wěn)定表達(dá)，是目前用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間相互作用的理想模型[10]。本實(shí)驗(yàn)以TNF-α構(gòu)建高血壓炎癥環(huán)境，并在Transwell小室孔板底部培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)側(cè)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，觀察內(nèi)皮細(xì)胞炎癥對(duì)血管平滑肌增殖、遷移的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激的共培養(yǎng)體系中血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)鋪路石樣的消失、細(xì)胞折光性降低，炎癥因子IL-1β水平升高、IL-10降低，并引起共培養(yǎng)體系中平滑肌細(xì)胞形態(tài)損傷。給藥干預(yù)后，復(fù)方七芍藥物血清組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組細(xì)胞形態(tài)呈不同程度恢復(fù)正常，折光率增高，炎癥因子IL-1β水平下降，IL-10水平升高，以MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組效果最為顯著。說(shuō)明復(fù)方七芍降壓片藥物血清能改善炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的形態(tài)損傷，抑制細(xì)胞上清液IL-1β、升高IL-10水平。

嘌呤受體P2Y6屬G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均有表達(dá)；內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體經(jīng)脂多糖或TNF-α刺激，呈現(xiàn)高表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥因子IL-8和血管細(xì)胞黏附分子-1分泌，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生[15]。與Gq/11蛋白偶聯(lián)后，可使MEK1/2蛋白活化，進(jìn)而激活ERK1/2，調(diào)控炎癥相關(guān)因子的表達(dá)[16]。ERK1/2作為細(xì)胞增殖和分化的主要途徑[17]，磷酸化水平升高，可誘導(dǎo)多種炎癥因子釋放，血管平滑肌增殖、遷移，引發(fā)病理性血管重塑[18]。趙京山等[19]發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃A通過(guò)下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中的MEK-ERK1/2的活性，抑制VSMC的增殖，防治病理性血管重塑；復(fù)方七芍降壓片可通過(guò)下調(diào)腸系膜動(dòng)脈中P2Y6受體表達(dá)，抑制下游信號(hào)通路（MEK1/2）/（ERK1/2）的活性，降低炎癥水平，起到改善血管重塑的作用[20]。同時(shí)，Nishimura等[21]發(fā)現(xiàn)，P2Y6可促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血壓升高，導(dǎo)致血管重構(gòu)，而P2Y6拮抗劑通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，能緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血壓升高，減弱血管重構(gòu)。有研究表明，MRS2578是P2Y6受體拮抗劑，可通過(guò)阻斷TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，改善血管重塑；P2Y6受體激動(dòng)劑UDP可刺激P2Y6受體上調(diào)，活化MEK-ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)控IL-8等炎癥因子的釋放，導(dǎo)致小腸炎癥的發(fā)生[22-24]。以上說(shuō)明，內(nèi)皮細(xì)胞中P2Y6受體高表達(dá)，可激活下游（MEK1/2）/（ERK1/2）信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，損傷平滑肌細(xì)胞，導(dǎo)致血管重塑的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和空白血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體高表達(dá)，其下游信號(hào)通路MEK1/2、ERK1/2蛋白及mRNA表達(dá)均升高，調(diào)控的炎癥因子IL-1β含量增加、IL-10含量減少。給藥干預(yù)后，與模型組比較，復(fù)方七芍藥物血清組、厄貝沙坦藥物血清組、MRS2578組、MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體表達(dá)降低，MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)降低，細(xì)胞上清液IL-1β含量減少、IL-10含量增加，以MRS2578＋復(fù)方七芍藥物血清組效果最顯著。提示復(fù)方七芍降壓片能降低內(nèi)皮細(xì)胞P2Y6受體及其下游信號(hào)通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)，抑制炎癥因子IL-1β水平，增加IL-10含量，改善血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)損傷。

綜上，復(fù)方七芍降壓片改善血管重塑的機(jī)制可能為調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞中P2Y6受體及其下游信號(hào)通路MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達(dá)，改善炎癥反應(yīng)，保護(hù)平滑肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能，抑制其增殖、遷移，改善血管重塑。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以內(nèi)皮細(xì)胞炎癥引起平滑肌細(xì)胞形態(tài)損傷來(lái)研究高血壓血管重塑，缺乏對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能、平滑肌細(xì)胞遷移及表型轉(zhuǎn)化等誘發(fā)血管重塑重要因素的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，有待今后進(jìn)一步研究。

[1] STACHON P, PEIKERT A, MICHEL N A, et al. P2Y6 deficiency limits vascular inflammation and atherosclerosis in mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(10)：2237–2245.

[2] LONG M E, EDDY W E, GONG K Q, et al. MEK1/2 inhibition promotes macrophage reparative properties[J]. J Immunol,2017,198(2)：862- 872.

[3] TANG Y M, CAO Q Y, GUO X Y, et al. Inhibition of p38 and ERK1/2 pathways by Sparstolonin B suppresses inflammation-induced melanoma metastasis[J]. Biomed Pharmacother,2018,98：382-389.

[4] 張智.嘌呤受體P2Y6在固有免疫中的功能及其機(jī)制研究[D].上海：華東師范大學(xué),2011.

[5] 張振,戴敏.丹皮酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)損傷的與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(6)：1058- 1063.

[6] 莫莉,卿俊,劉慧敏,等.復(fù)方七芍降壓片對(duì)高血壓血管外膜重構(gòu)的影響[J].臨床合理用藥雜志,2016,9(24)：21-24.

[7] 李國(guó)菁,雍蘇南,何澤云,等.復(fù)方七芍降壓片對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓及血液流變學(xué)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(8)：25-26.

[8] WANG L, MA R, LIU C, et al. Salvia miltiorrhiza： A potential red light to the development of cardiovascular diseases[J]. Curr Pharm Des,2017,23(7)：1077–1097.

[9] 黃慶,李志武,馬志國(guó),等.地龍的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2018,24(13)：220-226.

[10] 褚孟洋,張麗君,徐沁,等.共培養(yǎng)條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控平滑肌細(xì)胞功能的研究進(jìn)展[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,42(6)：631-634.

[11] PERROS F, RANCHOUX B, IZIKKI M, et al. Nebivolol for improving endothelial dysfunction, pulmonary vascular remodeling, and right heart function in pulmonary hypertension[J]. Journal of the American College of Cardiology,2015,65(7)：668-680.

[12] GILS J M V. Edothelial expression of guidance cues in vessel wall homeostasis dysregulation under proatherosclerotic conditions[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology, 2013,33(5)：911-919.

[13] 郭庶,譚海萍,張宗堯,等.血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管平滑肌細(xì)胞影響的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2017,23(24)：4801-4806.

[14] MA L Y A, MEI N, HAO P P. Tongxinluo mitigates atherogenesis by regulating angiogenic factors and inhibiting vasa vasorum neovascularization in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Oncotarget,2016,7(13)：16194-16204.

[15] 曾勇,文愛(ài)珍,王順民,等.P2Y6受體生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2016,24(1)：107-110.

[16] UNG M K, HAS, SON J A, et al. Polyphenon-60 displays a therapeutic effect on acne by suppression of TLR2 and IL-8 expression via down-regulating the ERK1/2 pathway[J]. Arch Dermatol Res,2012,304(8)：655-663.

[17] 孫紅霞,胡波,林慧嬌.北五味子多糖通過(guò)ERK1/2通路對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用機(jī)制[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2019,20(5)：640-644.

[18] 譚宏偉,許春容,王剛,等.微小RNA對(duì)血管重塑的調(diào)節(jié)作用及研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2019,27(12)：1094-1100.

[19] 趙京山,郭淺妤,賴少鴻,等.羥基紅花黃色素A可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[J]. 中華心血管病雜志,2015,43(8)：728-731.

[20] 任衛(wèi)瓊,李弘,劉葉倩,等.復(fù)方七芍降壓片對(duì)SHR大鼠P2Y6、MEK1/2、ERK1/2及血管重塑標(biāo)志物MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2020,31(2)：156-162.

[21] NISHIMURA A, SUNGGIP C, TOZAKI-SAITOH H, et al. Purinergic P2Y6 receptors heterodimerize with angiotensin AT1 receptors to promote angiotensin Ⅱ-induced hypertension[J]. Science Signaling, 2016,9(411)：ra7.

[22] 王順民,陸朵梅,黃露,等.復(fù)方七芍降壓片藥物血清對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2020,26(1)：34-38.

[23] NAKANO M, ITO K, YUNO T, et al. UDP/P2Y6 receptor signaling regulates IgE-dependent degranulation in human basophils[J]. Allergology International,2017,66(4)：574-580.

[24] DJORDJE M G, éMILIE D, JEAN-FR?OIS L, et al. P2Y6 receptor contributes to neutrophil recruitment to inflamed intestinal mucosa by increasing CXC chemokine ligand 8 expression in an AP-1-dependent manner in epithelial cells[J]. Inflammatory Bowel Diseases,2012,18(8)：1456-1469.

Effects of CompoundTablets on Expression of P2Y6 Signal Pathway Related Factors of Vascular Endothelial Cells Co-cultured with Smooth Muscle Cells Induced by TNF-α

LIU Yeqian1, LI Hong1, GONG Shan1, CHEN Chunming1, MA Danfeng2, LIU Lin1,WANG Zhiqi3, ZENG Yong1, WANG Yuhong4, REN Weiqiong1

To observe the effects of compoundTablets on inflammatory factors and P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 protein expressions of vascular endothelial cells co-cultured with smooth muscle cells induced by TNF-α; To explore the mechanism of compoundTablets in the treatment of hypertension.Co-culture system was established by vascular endothelial cells and smooth muscle cells, and inflammatory factor TNF-α was used to establish a microenvironment for hypertension inflammation. The cultured cells were randomly divided into normal control group, model group, blank serum control group, MRS2578 group, irbesartan tablet drug-containing serum group, compoundTablets containing serum group, and MRS2578+compoundTablets containing serum group. MRS2578 group and MRS2578+compoundTablets containing serum group were added with 10 μmol/L MRS2578, and the normal group and model group were added with the same amount of culture medium; the remaining groups were added with 10% drug-containing serum and blank serum. The morphology of endothelial cells and smooth muscle cells were observed using an inverted microscope; IL-1β and IL-10 levels of inflammatory factors in cell supernatant were detected by ELISA; immunofluorescence, Western blot and RT-qPCR were used to detect the expressions of P2Y6, MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells.Compared with the normal control group, the number of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in the model group and the blank serum control group was significantly reduced, the cell outline was not clear and the refractive index was reduced, and the number of floating dead cells increased; the level of IL-1β increased significantly and IL-10 decreased significantly (<0.01); P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the refraction of endothelial cells and smooth muscle cells increased, and the cell morphology returned to normal in compoundTablets containing serum group; the level of IL-1β decreased significantly; P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels decreased significantly (<0.01).CompoundTablets can obviously regulate TNF-α-induced endothelial inflammatory response, improve the injury of smooth muscle cells caused by endothelial inflammation, and maintain its normal function. The mechanism may be related to the regulation of protein expression of P2Y6 receptor and its downstream signaling pathways MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells and improvement of the inflammatory response.

compoundTablets; endothelial cell; smooth muscle cell; P2Y6-MEK1/2-ERK1/2; inflammation; vascular remodelin; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0058-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004401

國(guó)家自然科學(xué)基金（81473616）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目（201910）；湖南省科技廳項(xiàng)目（2018SK51203）；中醫(yī)內(nèi)科重大疾病防治及轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（ZYNK201703）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生校級(jí)創(chuàng)新課題（2019CX67）

任衛(wèi)瓊，E-mail：renweiqiong1@126.com

（2020-04-16）

（2020-04-28；編輯：華強(qiáng)）