余婧萍，賀春香，李澤，楊苗，成紹武，宋禎彥

論著·實(shí)驗(yàn)研究

芍藥苷對(duì)PINK1-Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬在H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的影響

余婧萍，賀春香，李澤，楊苗，成紹武，宋禎彥

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

觀察芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）細(xì)胞損傷中線(xiàn)粒體自噬的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。采用250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24 h構(gòu)建細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白組、模型組和芍藥苷低、中、高劑量組。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，JC-1線(xiàn)粒體膜電位熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位，TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測(cè)PINK1、Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白的表達(dá)。與空白組比較，模型組細(xì)胞存活率下降，線(xiàn)粒體膜電位下降，細(xì)胞凋亡率上升，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達(dá)升高，Parkin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；與模型組比較，芍藥苷低、中、高劑量組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位上調(diào)，細(xì)胞凋亡率下降，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達(dá)降低，Parkin蛋白表達(dá)升高。芍藥苷可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控PINK1-Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬途徑相關(guān)。

芍藥苷；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；過(guò)氧化氫；線(xiàn)粒體自噬；PINK蛋白；Parkin蛋白；信號(hào)通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床以進(jìn)行性的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶功能障礙為主要特征。目前，全球4700萬(wàn)人患有AD，預(yù)計(jì)2050年AD將影響1.35億人[1]。目前臨床對(duì)AD的治療手段十分有限，療效欠佳。AD病理組織學(xué)特征是不溶性β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）斑塊的胞外聚集和由過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofbrillary tangles，NFTs）的胞內(nèi)聚集。研究表明，氧化損傷是AD的主要特征，可出現(xiàn)在輕度認(rèn)知功能障礙及Aβ沉積和NFTs形成之前[2]。氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是由于活性氧（ROS）及氧化與抗氧化作用失衡引起的。線(xiàn)粒體是細(xì)胞中ROS的主要產(chǎn)生部位之一，線(xiàn)粒體容易因基質(zhì)中產(chǎn)生的ROS而引起氧化損傷。AD早期即存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)可損傷線(xiàn)粒體功能[3]，線(xiàn)粒體選擇性降解自噬（線(xiàn)粒體自噬）是大自噬的一種特殊形式，通過(guò)選擇性清除受損和功能異常的線(xiàn)粒體，可保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)度的氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡。線(xiàn)粒體自噬功能障礙會(huì)導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森病和AD[4-5]。因此，探索改善神經(jīng)元線(xiàn)粒體自噬功能障礙的有效藥物，對(duì)AD的早期防治具有重要臨床意義。

白芍最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛茛科多年生草本植物芍藥的干燥根。芍藥苷為水溶性單萜苷，是白芍的主要有效成分之一。芍藥苷具有抗炎、抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶能力等藥理作用[6-7]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過(guò)降低過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）內(nèi)的ROS水平，改善自噬-溶酶體系統(tǒng)功能，進(jìn)而改善細(xì)胞受損狀態(tài)[8]。但其對(duì)線(xiàn)粒體自噬調(diào)控及具體機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究芍藥苷干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，觀察其對(duì)線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞凋亡及PINK1/Parkin信號(hào)通路的影響，探討芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM-F12（1∶1）培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化重懸細(xì)胞，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求接種不同密度的細(xì)胞至各孔板中，或?qū)⒓?xì)胞懸液按1∶3比例接種于新的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2 藥物和試劑

芍藥苷（IP0030）、MTT（M8180）、JC-1線(xiàn)粒體膜電位熒光探針（J8030）、胰蛋白酶-EDTA消化液（T1320），中國(guó)索萊寶公司；二甲基亞砜（DMSO，D806645），中國(guó)麥克林公司；H2O2溶液（323381），美國(guó)Sigma公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1088），中國(guó)Beyotime公司；Triton X-100（9002-93-1），中國(guó)Beyotime公司；SDS-PAGE蛋白5×上樣緩沖液（P0015L），中國(guó)Beyotime公司；RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer，01408/504074），康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑混合物（CW2200），康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3227CH），美國(guó)Thermo Fisher公司；一抗Parkin（#4211），美國(guó)CST公司；一抗PINK1（sc-517353），美國(guó)SANTA CRUZ公司；一抗p62（ab56416），美國(guó)Abcam公司；一抗LC3（bs-8878R），北京博奧森生物有限公司；β-actin（bs-0061R），北京博奧森生物有限公司；山羊抗兔二抗（AP132P），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠二抗（AP124），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；10%胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；1%青霉素-鏈霉素混合液，美國(guó)Hyclone公司。

1.3 儀器

ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀，美國(guó)BIO-RAD公司；Medifuge?小型臺(tái)式離心機(jī)、Series 8000 WJ CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)ThermoFisher公司；Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡，德國(guó)ZEISS公司；Cytation3多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；A1+共聚焦激光顯微鏡，日本Nikon公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型制作

參照本課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)方法制作SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型[9]。

2.2 分組

待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將細(xì)胞接種于96孔板（約5×103個(gè)/孔）、12孔板（約1×105個(gè)/孔）和6孔板（約4×105個(gè)/孔），繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后，給予不同處理，分別設(shè)置空白組、模型組（250 μmol/L H2O2）和芍藥苷低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）劑量組。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率

96孔板中細(xì)胞經(jīng)H2O2、芍藥苷處理一定時(shí)間后，吸棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入10 μL MTT和90 μL完全培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液和MTT，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 s，490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－調(diào)零組OD值）÷（空白組OD值－調(diào)零組OD值）×100%。

2.4 JC-1熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位

12孔板中細(xì)胞經(jīng)處理后，吸棄培養(yǎng)基，加入工作濃度為1 μg/mL的JC-1熒光探針染液（DMSO配制），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 min，PBS輕洗細(xì)胞3次，使用Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡成像觀察，用Image J軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。平均熒光強(qiáng)度＝光密度總和÷熒光面積。以紅綠熒光平均熒光強(qiáng)度比值衡量線(xiàn)粒體去極化的比例。

2.5 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

12孔板中細(xì)胞經(jīng)處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；PBS洗細(xì)胞1次，用0.3%Triton X-100（PBS配制），室溫孵育5 min，PBS輕洗細(xì)胞2次；每孔加入50 μL檢測(cè)液（含5 μL TdT酶和45 μL熒光標(biāo)記液）；于37 ℃恒溫箱中避光孵育60 min，PBS洗細(xì)胞3次；用含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片，鏡下成像觀察染色結(jié)果。

2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

6孔板中細(xì)胞經(jīng)處理后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕洗3次，吸棄PBS；以5 μL/cm2計(jì)算，加入RIPA裂解液；按1∶50比例加入蛋白酶抑制劑；冰上搖晃20 s，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下，將液體和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中；冰上使用超聲破碎儀，超聲粉碎10 s；15 000×、4 ℃離心10 min，將上清移至新EP管。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將各組蛋白配制成2 μg/μL上樣緩沖液，100 ℃金屬浴20 min，使蛋白變性，-80 ℃保存。配制丙烯酰胺膠，每孔加30 μg樣品；80 V電泳30 min，100 V電泳120 min；用0.22 μm PVDF膜，200 mA、4 ℃濕轉(zhuǎn)90 min；用5%脫脂牛奶（TBST配制）室溫封閉1 h；按1∶1000稀釋PINK1、Parkin、LC3、p62，按1∶5000稀釋?duì)?actin，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；吸棄一抗，用TBST洗3次，每次10 min；按1∶10 000稀釋二抗，37 ℃搖床孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗3次，每次10 min，按1∶1配制顯影液，用凝膠成像儀成像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

SH-SY5Y細(xì)胞存活率受H2O2濃度及作用時(shí)間的影響，H2O2濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，SH-SY5Y細(xì)胞存活率越低。當(dāng)H2O2濃度為250 μmol/L、作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞存活率約為55%[9]，故本實(shí)驗(yàn)選擇250 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h建立細(xì)胞模型。給予不同濃度芍藥苷干預(yù)24 h后，MTT結(jié)果顯示，隨著芍藥苷濃度升高并不影響正常細(xì)胞的存活率，但濃度為40 μmol/L時(shí)會(huì)一定程度上影響細(xì)胞存活率，見(jiàn)表1。對(duì)250 μmol/L H2O2造模的細(xì)胞給予不同濃度芍藥苷干預(yù)后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯上升（＜0.05），且有一定的濃度相關(guān)性，見(jiàn)表2。根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，選擇低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）3個(gè)濃度芍藥苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度芍藥苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響（±s）

表2 不同濃度芍藥苷對(duì)H2O2作用SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.2 芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y線(xiàn)粒體膜電位的影響

線(xiàn)粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期一個(gè)重要的標(biāo)志性事件。JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可反映細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可將這一轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的檢測(cè)指標(biāo)。當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中，形成聚合物，形成紅色熒光；而當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，形成綠色熒光。通過(guò)JC-1熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位，結(jié)果顯示，空白組紅色熒光較強(qiáng)，提示線(xiàn)粒體膜電位較高；與空白組比較，模型組綠色熒光與紅色熒光比值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），提示模型組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降；與模型組比較，芍藥苷各劑量組綠色熒光與紅色熒光比值降低，提示細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位較模型組升高，其中芍藥苷中、高劑量組線(xiàn)粒體膜電位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見(jiàn)圖1、表3。

4.3 芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。當(dāng)基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上綠色熒光探針熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸，從而可通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組細(xì)胞凋亡率均降低，芍藥苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

4.4 芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y線(xiàn)粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞PINK1、p62和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組細(xì)胞PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達(dá)降低，Parkin蛋白表達(dá)升高，芍藥苷高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5、圖3。

圖1 各組SH-SY5Y線(xiàn)粒體膜電位比較（JC-1熒光探針，×200）

表3 各組SH-SY5Y線(xiàn)粒體膜電位比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

表4 各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×100）

表5 各組SH-SY5Y p62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

注：A.空白組；B.模型組；C.芍藥苷低劑量組；D.芍藥苷中劑量組；E.芍藥苷高劑量組

5 討論

有研究表明，芍藥苷可改善AD腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與抑制核因子-κB向核的轉(zhuǎn)運(yùn)和促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[10]，還可抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ負(fù)荷、Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活[11]。另外，芍藥苷還可減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷作用，與JAK2/STAT3和ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)[12]。前期研究結(jié)果顯示，大量ROS在細(xì)胞內(nèi)聚集會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[13]。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)程序性死亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至死亡[14]。AD早期存在線(xiàn)粒體功能紊亂，線(xiàn)粒體功能紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝、鈣離子平衡失調(diào)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。線(xiàn)粒體功能異常，以及相關(guān)的氧化應(yīng)激改變是AD患者大腦中神經(jīng)元受損最早出現(xiàn)且最突出的特征[15-16]。此外，研究表明，AD患者成纖維細(xì)胞在損傷后線(xiàn)粒體膜電位恢復(fù)較慢，溶酶體和自噬途徑發(fā)生改變，ROS聚集，這些改變可通過(guò)Parkin的過(guò)表達(dá)來(lái)挽救[17]，但其在神經(jīng)細(xì)胞中的改變及機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷可恢復(fù)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y線(xiàn)粒體膜電位下降，改善線(xiàn)粒體的功能； TUNEL染色結(jié)果顯示，芍藥苷可抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，對(duì)改善先于Aβ沉積及NFTs的形成之前就存在的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的影響具有重要意義。此外，線(xiàn)粒體膜電位的喪失可作為線(xiàn)粒體自噬的線(xiàn)索[18]。H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞自噬溶酶體功能受損，而芍藥苷可促進(jìn)其自噬溶酶體的形成，改善自噬受損。線(xiàn)粒體膜電位降低雖能激活線(xiàn)粒體自噬，但我們認(rèn)為，氧化損傷條件下的SH-SY5Y細(xì)胞自噬溶酶體功能受損可能影響線(xiàn)粒體自噬，阻礙受損線(xiàn)粒體的降解過(guò)程。

線(xiàn)粒體自噬在AD受損線(xiàn)粒體的降解中起重要作用[19-20]，自噬溶酶體系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致受損線(xiàn)粒體降解不足[21]；反之，線(xiàn)粒體功能障礙也可能損害該途徑。PINK1是一種線(xiàn)粒體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò)激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬，對(duì)線(xiàn)粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[22-23]。Parkin是一種胞質(zhì)的E3泛素連接酶，在線(xiàn)粒體的降解中起重要作用。PINK1與Parkin相互作用是線(xiàn)粒體質(zhì)量控制的基礎(chǔ)[24]，線(xiàn)粒體電位喪失可激活線(xiàn)粒體自噬[25-26]。當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位降低后，PINK1會(huì)積累在線(xiàn)粒體外膜上[27]，隨后將Parkin募集到線(xiàn)粒體外膜，泛素化存在于線(xiàn)粒體膜中的Mfn2蛋白，防止受損的線(xiàn)粒體與健康的線(xiàn)粒體融合，最終通過(guò)p62蛋白與LC3結(jié)合，使線(xiàn)粒體降解。本研究結(jié)果表明，芍藥苷干預(yù)后，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷Parkin表達(dá)升高，PINK1、LC3Ⅱ、p62表達(dá)降低。此外，本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，芍藥苷可通過(guò)降低LC3Ⅱ表達(dá)，促進(jìn)p62蛋白降解而調(diào)節(jié)H2O2損傷后SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平。因此，我們認(rèn)為，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷PINK1表達(dá)升高是因?yàn)樵摰鞍自诩?xì)胞內(nèi)蓄積，并非合成增多；芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，是通過(guò)提高Parkin的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)PINK1將Parkin募集到受損的線(xiàn)粒體，促進(jìn)受損線(xiàn)粒體的降解。因此，PINK1水平降低，Parkin水平升高。

本研究使用H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y為細(xì)胞模型，通過(guò)MTT法確定細(xì)胞損傷的適宜濃度與時(shí)間點(diǎn)確定模型條件[9]。結(jié)果顯示，H2O2濃度為250 μmol/L、作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞存活率約為55%，該濃度下細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡率增加。芍藥苷干預(yù)后，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位有所恢復(fù)，細(xì)胞凋亡得以抑制，Parkin表達(dá)升高，PINK1、LC3Ⅱ和p62表達(dá)降低；提示芍藥苷對(duì)SH-SY5Y氧化應(yīng)激損傷有治療作用。因此，我們認(rèn)為，芍藥苷可降低H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，通過(guò)過(guò)表達(dá)Parkin蛋白，促進(jìn)PINK1與Parkin的結(jié)合來(lái)調(diào)控線(xiàn)粒體自噬，恢復(fù)線(xiàn)粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡，改善細(xì)胞受損狀態(tài)。

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Effects of Paeoniflorin on PINK1-Parkin Mediated Mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y Cell Damage

YU Jingping, HE Chunxiang, LI Ze, YANG Miao, CHENG Shaowu, SONG Zhenyan

To explore the regulatory effects of paeoniflorin on mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y cell damage; To discuss its mechanism of action.250 μmol/L H2O2was used to induce SH-SY5Y for 24 h to construct a cell injury model. The blank group, model group and paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups were involved in the experiment. Methyl thiazolyl tetrazolium assay was used to detect cell survival rate. JC-1 mitochondrial membrane potential fluorescent probe was used to detect mitochondrial membrane potential. TUNEL staining was used to detect apoptosis rate. Western blot was adopted to detect the protein expression levels of PINK1, Parkin, LC3Ⅱ and p62.Compared with the blank group, the cell survival rate of the model group decreased; the mitochondrial membrane potential decreased; the apoptosis rate increased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 protein increased; the expression of Parkin protein did not change significantly. Compared withmodel group, the mitochondrial membrane potential of paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups increased; the apoptosis rate decreased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 proteindecreased;the expression of Parkin proteinincreased.Paeoniflorin can significantly reduce H2O2-induced SH-SY5Y cell damage, and the mechanism of action may be related to the regulation of PINK1-Parkin-mediated mitophagy pathway.

paeoniflorin; SH-SY5Y; hydrogen peroxide; mitochondrial autophagy; PINK1; Parkin; signal pathway

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0045-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004479

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81774129）；湖南省自然科學(xué)基金（2018JJ2296、2019JJ50441）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（2018025）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研項(xiàng)目（18B246）

宋禎彥，E-mail：songzhenyan2013@hnucm.edu.cn

（2020-04-20）

（2020-04-29；編輯：華強(qiáng)）