李思怡，白博文，張媚，王雨佳，周鑫宇，趙玉巖

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，沈陽 110001）

糖尿病是一種并發(fā)癥眾多，病程長的慢性疾病。胰島β細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損從而導(dǎo)致胰島素分泌減少是糖尿病患者血糖升高的重要原因，因此，雌激素能夠降低糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)可能與其對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。雌激素可以防止胰島β細(xì)胞凋亡，維持胰島素分泌，延緩糖尿病發(fā)?。?］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女的糖尿病發(fā)病率比絕經(jīng)前婦女高。多個(gè)研究［2-3］證實(shí)，雌激素替代療法可以顯著降低絕經(jīng)后婦女的糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)。線粒體自噬既可以維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，又可以減少線粒體數(shù)量從而影響細(xì)胞存活，關(guān)于線粒體自噬對胰島β細(xì)胞影響的研究目前較為少見。本文通過研究雌激素對胰島β細(xì)胞 （Min6細(xì)胞） 線粒體自噬的影響，探討雌激素對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)用Min6細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基 （美國Gibco公司），胎牛血清 （美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶 （美國Gibco公司），雌二醇 （美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），Beclin-1 Antibody （英國Abcam公司），LC3B Antibody （英國Abcam公司），HSP60 Antibody（英國Abcam公司），TOM20 Antibody （英國Abcam公司），GAPDH Antibody （英國Abcam公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒 （中國弗德生物科技有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 （中國碧云天生物技術(shù)公司）。

1.1.3 儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司），超凈工作臺(tái) （中國蘇州凈化設(shè)備有限公司），透射電子顯微鏡 （日本JEOL公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀/熒光酶標(biāo)儀 （瑞士Tecan公司），電泳儀 （美國Bio-Rad公司），電轉(zhuǎn)膜裝置 （美國Bio-Rad公司），圖像分析軟件 （美國Scoin Corporration）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：Min6細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，使用25 cm2培養(yǎng)瓶并在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%生長密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化獲得單細(xì)胞懸液，按1 ∶2～1 ∶3的比例傳代。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2的最適作用濃度為10-7mol/L，最適作用時(shí)間為24 h，將同時(shí)段培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分為對照組 （培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h） 和E2組（10-7mol/L E2處理細(xì)胞24 h）。

1.2.2 透射電子顯微鏡觀察：細(xì)胞按照分組處理后用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液收集離心，棄上清，沿管壁緩慢滴入預(yù)冷過的2.5%戊二醛，4 ℃固定1 h，PBS洗滌2次。1%鋨酸4 ℃固定1 h后PBS再次洗滌3次，進(jìn)行電鏡標(biāo)本脫水、包埋、切片 （厚度70～90 nm），檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液分別染色15 min。透射電鏡觀察，收集圖像。

1.2.3 Western blotting：細(xì)胞按照分組處理后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用刮板收集細(xì)胞；RIPA裂解液冰上提取蛋白，采用BCA試劑盒蛋白定量；將定量好的蛋白與樣品用移液槍移至事先配置好的濃縮膠和分離膠中，開始電泳 （濃縮膠中電壓70 V，分離膠中電壓改為120 V）；將蛋白通過轉(zhuǎn)膜 （200 mA） 從分離膠中轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA溶液封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗4 ℃孵育過夜；去除一抗，TBST洗膜10 min×3次，二抗搖床上孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光，熒光成像儀曝光成像，Image J分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2減少M(fèi)in6細(xì)胞中線粒體自噬體形成

電鏡結(jié)果顯示，與對照組相比，E2組中線粒體自噬體數(shù)量較少，見圖1。

圖1 E2減少M(fèi)in6細(xì)胞中線粒體自噬體的形成 ×20 000Fig.1 E2 reduces the formation of mitochondrial autophagosomes in Min6 cells ×20 000

2.2 E2對Min6細(xì)胞線粒體自噬的影響

與對照組 （0.82±0.09，0.63±0.03） 相比，E2組HSP60 （1.32±0.07） 和TOM20 （0.83±0.01） 表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.001 8和P=0.000 4）。與對照組 （1.30±0.10，1.14±0.09，1.04±0.08） 相比，E2組Beclin-1 （0.99±0.13）、LC3Ⅱ （0.79±0.08） 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ （0.78±0.09） 的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.033 3，P=0.009 6和P=0.023 4），見圖2。

3 討論

糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引發(fā)的一種慢性疾病，隨著社會(huì)發(fā)展與人們生活方式的變化，糖尿病的發(fā)病率在近幾十年呈上升趨勢。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)，2017年全球糖尿病患病率已有8.4%，據(jù)估計(jì)，2045年糖尿病患病率將上升至9.9%［4］。與同齡男性相比，絕經(jīng)后女性糖尿病的發(fā)病率更高，且并發(fā)癥發(fā)生速度更快，可能與體內(nèi)雌激素水平降低有關(guān)。雌激素是人體內(nèi)一種已經(jīng)被證明對胰島功能具有保護(hù)作用的類固醇激素［5-6］，現(xiàn)有研究［7-8］證實(shí)Min6細(xì)胞中存在雌激素經(jīng)典受體ERα和新型受體GPER表達(dá)，但相關(guān)文獻(xiàn)較少，團(tuán)隊(duì)的前期研究已經(jīng)證實(shí)了GPER在Min6細(xì)胞中表達(dá)，提示雌激素可能通過與受體結(jié)合參與Min6細(xì)胞的生理過程。

圖2 Western blotting檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of mitochondrial autophagy-related proteins measured using western blotting

自噬是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一種過多或異常蛋白質(zhì)自我降解過程［9］，而過度的自噬會(huì)引起胰島β細(xì)胞的功能損害［10］，進(jìn)而增加糖尿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。線粒體存在于真核細(xì)胞中，具有雙模結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞的供能細(xì)胞器。其過氧化磷酸化生成的能量貨幣ATP通過參與多種代謝途徑，為細(xì)胞正常活動(dòng)提供大量能量，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［11］。線粒體自噬有助于維持線粒體的健康和能量來源［12］，而過度的自噬會(huì)損害線粒體功能并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［13］。目前關(guān)于雌激素對胰島β細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制尚不清楚，推測可能與雌激素對線粒體自噬的調(diào)控有關(guān)，為證實(shí)這一推測本研究檢測了線粒體自噬體數(shù)量、線粒體相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白。

線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化可以反映線粒體總量的改變，從而進(jìn)一步反映細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生。同時(shí)選取線粒體基質(zhì)蛋白HSP60、線粒體膜蛋白TOM20進(jìn)行檢測，可以更全面地反映線粒體總量的變化。HSP60是由線粒體損傷引起的線粒體應(yīng)激蛋白，主要定位于線粒體基質(zhì)，在線粒體基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮作用［14］，是一種典型的線粒體分子伴侶。TOM20是一種線粒體外膜的轉(zhuǎn)位酶，通過其N端疏水片段錨定于線粒體外膜上，其親水域暴露于胞質(zhì)側(cè)［15］。在檢測線粒體蛋白表達(dá)量時(shí)，同時(shí)選用線粒體基質(zhì)蛋白HSP60和內(nèi)膜蛋白TOM20來反映線粒體自噬活性更具有嚴(yán)謹(jǐn)性。Beclin-1通過調(diào)節(jié)PI3K生成和促進(jìn)自噬體形成的ATG蛋白質(zhì)來控制自噬過程［16］，是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。LC3與自噬體的發(fā)育和成熟相關(guān)，對自噬的發(fā)生至關(guān)重要，因此是公認(rèn)的自噬活性評估標(biāo)志蛋白，用于監(jiān)測自噬活性［17］。自噬發(fā)生時(shí)，LC3從細(xì)胞質(zhì)形式 （LC3Ⅰ） 轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺綴合形式 （LC3Ⅱ），并隨后被募集至自噬體膜［18］，因此可以用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ來表示自噬的水平。本研究結(jié)果顯示，在E2處理過的Min6細(xì)胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ減少，提示E2組自噬被抑制。同時(shí)E2組HSP60與TOM20蛋白相比對照組有所增加，說明E2組細(xì)胞內(nèi)線粒體總量增多，線粒體自噬被抑制。電鏡下E2組Min6細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬體數(shù)量比對照組有所減少也證實(shí)了這一結(jié)果。因此，本研究證實(shí)了雌激素對胰島β細(xì)胞的線粒體自噬起抑制作用，其具體的作用機(jī)制與途徑仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，雌激素可能通過抑制線粒體自噬發(fā)揮對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用，從而降低糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這一結(jié)論可以為絕經(jīng)后婦女的糖尿病治療與研究提供新的思路和理論依據(jù)。