劉 玉，楊 鍵，李 茹，龍麗娟,3**

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣東廣州 511458)

0 引言

芳香族化合物是一類典型的有機(jī)污染物，在環(huán)境中分布廣泛。該類化合物能夠通過多種途徑進(jìn)入環(huán)境，且具有半衰期長(zhǎng)、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、毒性高等特點(diǎn)，能夠被生物吸收富集并通過食物鏈傳遞，威脅人類健康與生態(tài)環(huán)境安全[1，2]。如何高效安全地消除這些有機(jī)污染物成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。環(huán)境微生物(細(xì)菌、真菌、藻類)能夠依靠體內(nèi)酶系統(tǒng)代謝天然或合成的芳香族化合物，是芳香族化合物生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者[3-6]。Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶能夠催化芳香環(huán)特定位置的雙羥基化反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的順式二氫二醇或二醇羧酸[7，8]，從而降解芳香族化合物。有關(guān)Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的研究多集中在新型雙加氧酶的分離純化[9]、晶體結(jié)構(gòu)[10]、催化機(jī)制[11]、蛋白質(zhì)工程[12，13]等方面，有效促進(jìn)了該類酶在生物修復(fù)以及化學(xué)合成等領(lǐng)域的應(yīng)用。該類酶具有催化化學(xué)反應(yīng)多樣性、高度立體選擇性等特點(diǎn)，具有非生物催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，并在手性中間產(chǎn)物合成中發(fā)揮著巨大的作用，有望被開發(fā)為高效綠色催化劑[14]。

Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶能夠催化包括羥基化、環(huán)氧化、去甲基化、去飽和、氯化等在內(nèi)的多種化學(xué)反應(yīng)[15]，其生物學(xué)作用不僅僅局限于芳香族化合物的降解，而且還能參與一系列分解代謝與生物合成途徑中的氧化轉(zhuǎn)化。選擇性氧化是催化領(lǐng)域的重要課題，目前基于重金屬的催化劑既昂貴又不環(huán)保，因此尋找低廉環(huán)保、立體選擇性和區(qū)域選擇性高、催化高效的人工催化劑成為研究的熱點(diǎn)。Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶本身具有天然的、無(wú)可比擬的高效催化能力，在開發(fā)能夠氧化底物多樣性且具有區(qū)域選擇性和立體特異性的催化劑上擁有廣闊的前景。為深入了解Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的化學(xué)反應(yīng)過程和選擇性催化機(jī)理，本文對(duì)微生物Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的分類、催化功能多樣性、蛋白結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制以及蛋白質(zhì)工程等方面的研究進(jìn)行綜述，期望為該類酶的進(jìn)一步理論分析與實(shí)際應(yīng)用提供借鑒。

1 Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的分類

Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶是含有Rieske[2Fe-2S]中心的多組分酶系統(tǒng)，多數(shù)由末端氧化酶、還原酶和鐵氧還原蛋白3部分組成[16]。其中，末端氧化酶由α亞基或αβ亞基共同組成[17]，均含有一個(gè)Rieske[2Fe-2S]中心和一個(gè)單核鐵活性位點(diǎn)。還原酶組分是一種含有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黃素單核苷酸(FMN)的黃素蛋白，一些還原酶組分中同樣含有[2Fe-2S]中心[7]。鐵氧還原蛋白是含有[Fe-S]中心的小型酸性蛋白[8]，根據(jù)[Fe-S]中心鐵硫原子的連接數(shù)目可分為[2Fe-2S]和[3Fe-4S]兩類[18]。最初，依據(jù)Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的組分不同以及氧化還原中心性質(zhì)差異，將雙加氧酶分為三大類[16,19](表1)。然而隨著更多新型加氧酶的發(fā)現(xiàn)，該靜態(tài)分類系統(tǒng)存在著一定的局限性。Kweon等[18]基于多組分酶系統(tǒng)，將加氧酶作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，提出一個(gè)較為完善的新型動(dòng)態(tài)分類系統(tǒng)。他們首先根據(jù)氧化酶的α亞基或αβ亞基組成將其分為兩類，并根據(jù)保守區(qū)序列的不同將還原酶分為GR型、FNRC型、FNRN型3類，將鐵氧還原蛋白分為[2Fe-2S]和[3Fe-4S]兩類，最后綜合以上多組分的類別，將加氧酶共分為五大類：Ⅰ類是由氧化酶和FNRC型還原酶組成的雙組分系統(tǒng)；Ⅱ類是由氧化酶和FNRN型還原酶組成的其他雙組分系統(tǒng)；Ⅲ類是由氧化酶、FNRN型還原酶和[2Fe-2S]型鐵氧還原蛋白組成的三組分系統(tǒng)；Ⅳ類是由氧化酶、GR型還原酶和[2Fe-2S]型鐵氧還原蛋白組成的三組分系統(tǒng)；Ⅴ類是由氧化酶、GR型還原酶和[3Fe-4S]型鐵氧還原蛋白組成的三組分系統(tǒng)。該分類系統(tǒng)能夠反映新的序列信息以及加氧酶組分之間的相互作用，可用于不完全的加氧酶分類。

表1 Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶分類[16,19]Table 1 Classification of Rieske-type aromatic ring dioxygenases[16,19]

2 催化功能多樣性

Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶能夠催化多種反應(yīng)，包括羥基化、環(huán)氧化、去飽和、氯化、脫烷基、去甲基化等(圖1)[14]。例如，萘雙加氧酶不僅能夠催化多種雙環(huán)和三環(huán)的芳香族化合物雙羥化反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)的二氫二醇，而且能催化其他氧化反應(yīng)，包括單羥化、去飽和、脫烷基化和亞砜化等[20]。同屬非血紅素鐵依賴型的Fe2+/α酮酸雙加氧酶也能夠以加氧的方式催化類黃酮進(jìn)行環(huán)羥化、氧化、去飽和等反應(yīng)[21](表2)。Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶具有寬泛的底物特異性，Baboshin等[22]研究認(rèn)為芳香環(huán)羥化雙加氧酶催化芳香烴化合物的特異性存在兩個(gè)特征：1)同一的雙加氧酶可催化不同的底物羥基化；2)對(duì)于不同的底物，同一雙加氧酶表現(xiàn)的活性不同。計(jì)算分析結(jié)果顯示，來(lái)自Sphingobiumsp.PNB的Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶具有降解多種芳香族化合物的能力，證明該加氧酶具有寬泛的底物特異性[10]。不同來(lái)源的聯(lián)苯雙加氧酶(BPDO)對(duì)同類底物的偏好和區(qū)域特異性存在顯著差異，可以催化甲苯、多氯聯(lián)苯、羥基聯(lián)苯等底物[17,23]。來(lái)自PseudomonasKF707的聯(lián)苯雙加氧酶BPDOKF707不能催化聯(lián)苯的3,4-位雙羥基化，但對(duì)二氯聯(lián)苯同系物卻表現(xiàn)出不同的活性，較2,2′-或3,3′-二氯聯(lián)苯而言，優(yōu)先轉(zhuǎn)化4,4′-二氯聯(lián)苯[24]。另外，雖然BurkholderiaxenovoransLB400的聯(lián)苯雙加氧酶BPDOLB400與BPDOKF707的序列同源性超過95%，但BPDOLB400的轉(zhuǎn)化范圍更廣。BPDOLB400能夠優(yōu)先轉(zhuǎn)化含有多達(dá)6個(gè)氯的鄰位取代同系物，也能催化2,2′,5,5′-四氯聯(lián)苯3,4雙羥基化，還能催化某些二氯同系物的脫鹵作用，產(chǎn)生2,3-二羥基聯(lián)苯。BPDOLB400與PandoraeapnomenusaB-356的聯(lián)苯雙加氧酶BPDOB-356均能催化聯(lián)苯，但BPDOB-356具有更高的轉(zhuǎn)化效率。聯(lián)苯雙加氧酶的α亞基(BphA1)直接影響酶的催化活性和底物特異性[25]，該差異性是由α亞基上少量的氨基酸差異造成的[26]。BphA1活性位點(diǎn)中的氨基酸殘基具有不同的作用，協(xié)同決定了酶的底物特異性[27]。β亞基對(duì)底物特異性的影響存在著兩種不同的看法。Hurtubise等[28]通過對(duì)BPDOB-356和BPDOLB400的αβ亞基進(jìn)行交叉重組實(shí)驗(yàn)，證明α和β亞基均影響酶與底物的相互作用，其中β亞基的結(jié)構(gòu)不僅能影響酶對(duì)催化底物的氧結(jié)合能力，還能影響底物的反應(yīng)模式。α和β亞基的結(jié)構(gòu)特征決定了催化口袋的大小和形狀，進(jìn)而影響氧化底物的范圍，如Sphingobiumsp.PNB的α亞基結(jié)構(gòu)包含一個(gè)非常大的底物結(jié)合口袋，可以滿足容納高分子量底物的空間要求，因此能夠催化多種芳香烴化合物[10]。而Kauppi等[29]研究工作表明α亞基是控制底物特異性的主要成分，β亞基似乎不參與底物的催化，可能僅作用于酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖1 Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶化學(xué)反應(yīng)Fig.1 Chemical reaction of Rieske-type aromatic ring dioxygenases

表2 Rieske型加氧酶催化多樣性Table 2 Diversity of Rieske-type oxygenases catalyzed reactions

3 蛋白結(jié)構(gòu)

Kauppi等[29]和Furusawa等[27]通過X-射線衍射方式分別解析出來(lái)自Rhodococcus的萘雙加氧酶和聯(lián)苯雙加氧酶的晶體結(jié)構(gòu)。隨后,來(lái)自Sphingomonas的環(huán)羥化雙加氧酶和Sphingobium的聯(lián)苯雙加氧酶等的晶體結(jié)構(gòu)也相繼被表征[33-35]。在芳香環(huán)雙加氧酶中，對(duì)萘和聯(lián)苯雙加氧酶的研究較為深入，而這兩種酶的晶體結(jié)構(gòu)也是最早被解析出來(lái)的，為其他雙加氧酶的三維結(jié)構(gòu)研究提供了參考。聯(lián)苯雙加氧酶采用α3β3構(gòu)型，為六聚體結(jié)構(gòu)，呈蘑菇狀(圖2a)。蘑菇的帽部由α亞基組成，莖部由β亞基組成。其整體結(jié)構(gòu)以及各亞基的結(jié)構(gòu)與萘雙加氧酶(NDO)十分相似。每個(gè)αβ聚體通過一個(gè)非結(jié)晶的3倍軸與其他αβ聚體連接，且3個(gè)αβ聚體間沒有明顯的結(jié)構(gòu)差異。SphingobiumyanoikuyaeB1的BPDOB1的α亞基由460個(gè)氨基酸殘基組成，含兩個(gè)與催化過程密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，分別為催化域和Rieske域，共同介導(dǎo)氧原子和電子轉(zhuǎn)移[36]。BPDOB1催化域含有一個(gè)單核鐵活性位點(diǎn)，單核鐵與兩個(gè)組氨酸(His)、一個(gè)天冬氨酸(Asp)及一個(gè)水分子(H2O)配位(圖2b)，組氨酸和天冬氨酸在酶中高度保守。BPDOB1Rieske域中兩個(gè)硫化物離子橋接兩個(gè)鐵離子，形成扁平菱形排列，其結(jié)構(gòu)與BPDO系統(tǒng)的鐵氧還蛋白組分相似[27]，包含一個(gè)Rieske[2Fe-2S]中心，并與兩個(gè)半胱氨酸(Cys)和兩個(gè)His配位結(jié)合(圖2b)。BPDOB1中α亞基內(nèi)的單核鐵與Rieske[2Fe-2S]中心的距離約為40 ?(萘雙加酶中兩者的距離約為44 ?)，而與相鄰α亞基單核鐵的距離約為12 ?，比同一個(gè)亞基內(nèi)的距離短得多[17]。在酶反應(yīng)過程中，電子由Rieske[2Fe-2S]中心傳遞至單核鐵，距離特征表明電子更可能在α亞基之間發(fā)生轉(zhuǎn)移。單核鐵活性中心與相鄰α亞基的Rieske[2Fe-2S]中心之間存在氫鍵，鐵硫中心His121的N原子與相鄰α亞基的Asp221的O1原子形成氫鍵，Asp221的O2原子與His224的N原子形成氫鍵，其側(cè)鏈與單核鐵配位。因此，Asp221通過氫鍵連接兩個(gè)中心，起到了橋梁作用。如果Asp被其他氨基酸取代，酶會(huì)失去所有活性[17]。Pseudomonassp.NCIB 9816-4萘雙加氧酶的β亞基由6條長(zhǎng)且扭曲的混合β片組成，其中3條鏈的長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸殘基。在折疊層的凹面上有3個(gè)螺旋，在折疊層的凸面上有一個(gè)附加的N端螺旋，β亞基上最接近鐵活性位點(diǎn)和Rieske中心的原子距離大約為10 ?[29]。

圖2 聯(lián)苯雙加氧酶結(jié)構(gòu)及活性中心Fig.2 Structure of biphenyl dioxygenase and its active sites

4 催化機(jī)制

目前對(duì)萘雙加氧酶的催化機(jī)制研究較多，萘雙加氧酶催化萘降解的初始反應(yīng)，利用分子氧和NAD(P)H實(shí)現(xiàn)萘的順式1,2-雙羥基化[14，37](圖3)。黃素蛋白還原酶與鐵氧還原蛋白共同組成電子傳遞鏈，將來(lái)自NAD(P)H的電子轉(zhuǎn)移到末端氧化酶的Rieske[2Fe-2S]中心，鐵硫中心接收電子，并將電子傳遞給單核鐵活性位點(diǎn)，該單核鐵激活分子氧以插入底物的苯環(huán)當(dāng)中[19]。在沒有鐵氧還原蛋白的雙加氧酶系統(tǒng)中，黃素蛋白還原酶自身存在著與鐵氧還原蛋白相似的[2Fe-2S]中心，也能夠起到電子傳遞的作用[38]。鐵氧還原蛋白分子質(zhì)量小,方便移動(dòng)，大大提高了電子的傳遞效率，因此雙加氧酶系統(tǒng)的演化方向更傾向于鐵氧還原蛋白的存在。

圖3 萘雙加氧酶催化途徑[14]Fig.3 Catalytic pathway for naphthalene dioxygenase[14]

在末端氧化酶相鄰的α亞基中，保守的Asp作為連接Rieske[2Fe-2S]中心和單核鐵中心的橋梁，在催化過程中能夠引導(dǎo)電子的轉(zhuǎn)移[39,40]。單核鐵中心在靜止?fàn)顟B(tài)下是一個(gè)扭曲的八面體幾何結(jié)構(gòu)[41]，底物與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致亞鐵離子配位幾何結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Rieske[2Fe-2S]中心的還原導(dǎo)致一個(gè)電子減少，使得連接單核鐵中心的天冬氨酸向組氨酸殘基移動(dòng)，并改變了單核鐵中心的配位幾何結(jié)構(gòu)，為雙氧結(jié)合提供了足夠的空間[42]。聯(lián)苯雙加氧酶晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，末端氧化酶在與底物結(jié)合時(shí)其活性位點(diǎn)的氨基酸殘基發(fā)生了移動(dòng)，從而導(dǎo)致空間構(gòu)象出現(xiàn)了顯著的變化[27]。未與底物結(jié)合前，活性位點(diǎn)的催化口袋太小，無(wú)法容納聯(lián)苯分子，且沒有進(jìn)入催化口袋的入口；與底物結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，從而產(chǎn)生了通向催化口袋的通道，并擴(kuò)大了催化口袋的空間以容納聯(lián)苯。另外,只有在結(jié)合了底物且[2Fe-2S]中心被還原后，氧分子才與活性位亞鐵離子結(jié)合，這種機(jī)制可以防止在沒有底物的情況下雙氧與活性位點(diǎn)的結(jié)合，從而保護(hù)酶的氧化活性[40]。酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析能夠更深層次地揭示催化口袋在底物結(jié)合時(shí)發(fā)生的重要構(gòu)象變化，探討底物進(jìn)入活性中心的模式。

5 蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程已經(jīng)被用來(lái)提高Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的催化速率、底物特異性和立體選擇性。依據(jù)目前對(duì)酶結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)，設(shè)計(jì)改造雙加氧酶是優(yōu)化和提升微生物生物催化能力的有效手段?；诨钚晕稽c(diǎn)的定點(diǎn)誘變和基因重組技術(shù)可以獲得更加高效降解芳香族化合物的雙加氧酶突變體(表3)。Barriault等[30]已經(jīng)證明聯(lián)苯雙加氧酶α亞基中氨基酸與底物識(shí)別有關(guān)，定點(diǎn)誘變?chǔ)羴喕邪被幔l(fā)現(xiàn)部分氨基酸的取代能夠改變酶對(duì)底物的特異性或提高酶的催化效率。這些氨基酸的位置靠近單核鐵活性中心，可能在酶的催化活性中起一定的作用。對(duì)Burkholderia2,4-二硝基甲苯雙加氧酶(DDO)α亞基的I204位點(diǎn)飽和突變，突變體DDO提高了對(duì)2,4-和2,6-對(duì)二硝基甲苯的氧化能力[43]。Bernath-Levin等[44]通過多種蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到硝基苯雙加氧酶突變體，其催化能力是野生型的3倍。突變體主要通過增大底物結(jié)合口袋空間和改變底物結(jié)合模式的方式提高酶的活性。對(duì)Pseudomonassp.NCIB 9816-4萘雙加氧酶的誘變研究揭示，活性位點(diǎn)的幾何形狀變化與酶的結(jié)構(gòu)-功能存在關(guān)系，在F202，A206，V260，H295，F(xiàn)352和L307位點(diǎn)引入單點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致酶的底物特異性、區(qū)域選擇性和立體選擇性發(fā)生劇烈變化，但同時(shí)保留對(duì)天然底物萘的活性[13]。同樣地，通過改變一個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸側(cè)鏈的大小，能夠改變酶的區(qū)域選擇性和立體選擇性[12]。此外，利用基因重組技術(shù)可以將一個(gè)雙加氧酶α亞基碳端的部分片斷替換到另一個(gè)雙加氧酶α亞基上，獲得的新的活性雙加氧酶同時(shí)具有兩個(gè)親本的催化特性[45]。DNA改組技術(shù)發(fā)現(xiàn)萘雙加氧酶的225和407位點(diǎn)殘基，對(duì)酶的底物特異性產(chǎn)生影響，并可以提高酶對(duì)二硝基甲苯的活性[46]，另外對(duì)聯(lián)苯雙加氧酶DNA的改組實(shí)驗(yàn)獲得了高效降解多氯聯(lián)苯及其同系物的基因[47]。

表3 芳香環(huán)雙加氧酶的蛋白質(zhì)工程改造Table 3 Protein engineering of aromatic ring dioxygenases

6 應(yīng)用

芳香族化合物在自然環(huán)境中廣泛存在，且對(duì)生物安全存在一定的危害，如何從環(huán)境中有效地消除這些化合物備受關(guān)注。微生物利用體內(nèi)Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶降解芳香族有機(jī)污染物是環(huán)境微生物修復(fù)的重要過程[49]。Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶具有寬泛的底物特異性，能催化多種底物的立體選擇性反應(yīng)，這些特性使它們成為化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域重要手性化合物的合成催化劑，也為研發(fā)高效污染物微生物修復(fù)技術(shù)提供關(guān)鍵基礎(chǔ)信息[50]。Narancic等[51]在新分離出的PseudomonasTN301中發(fā)現(xiàn)，鄰苯二酚在多種鄰苯二酚雙加氧酶的作用下經(jīng)連續(xù)分解，最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水。劉如洋[52]將芳香環(huán)羥化雙加氧酶的編碼基因通過基因重組的方式整合到SWH-2菌株上，能夠提高該菌對(duì)菲的降解能力，同時(shí)可將該菌應(yīng)用于石油污染土壤的生物修復(fù)。高純度手性化合物作為藥物中間體在醫(yī)藥領(lǐng)域需求旺盛，而傳統(tǒng)化學(xué)合成法不具備酶法立體選擇性特征，較難獲得手性純化合物，生產(chǎn)成本昂貴[53]。雙加氧酶羥基化反應(yīng)主要產(chǎn)生順式二氫二醇中間體，該中間體可用于合成手性化合物。Janna等[54]利用Comamonassp.硝基苯雙加氧酶突變體能夠氧化硫代苯甲醚、對(duì)甲苯異氰酸酯等硫化物的能力,合成手性亞砜。盡管這些酶是非常有前途的生物催化劑，但是它們對(duì)NAD(P)H的依賴性、多組分性質(zhì)以及在非細(xì)胞系統(tǒng)中的固有不穩(wěn)定性阻礙其實(shí)際應(yīng)用，目前大多數(shù)利用Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶合成化學(xué)品的應(yīng)用主要依靠全細(xì)胞催化[55]。

7 展望

Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶來(lái)源豐富，是一類廣泛存在的多組分酶，其介導(dǎo)的催化反應(yīng)不僅是有機(jī)污染物降解的重要途徑，也可用于生產(chǎn)制備重要手性化合物中間體。目前關(guān)于酶的組分、晶體機(jī)構(gòu)和催化原理已有所了解，但是仍有許多細(xì)節(jié)值得深入研究。例如酶組分之間的相互作用、電子傳遞過程中活性位點(diǎn)的鐵離子絡(luò)合物的變化，以及不同氨基酸殘基與底物如何相互作用從而影響酶的特異性等。

基因組學(xué)的飛速發(fā)展使得更多的雙加氧酶家族成員被發(fā)現(xiàn)，極大地?cái)U(kuò)展了該類型酶的底物譜與催化反應(yīng)范圍，為更多的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程研究提供了豐富資源。目前基于計(jì)算模擬和分子對(duì)接等技術(shù)，雙加氧酶的催化特性與底物范圍研究取得一定的進(jìn)展，但是在氧化過程中所產(chǎn)生的反應(yīng)中間體的性質(zhì)仍有待明確和充分表征。Sutherlin等[56]研究發(fā)現(xiàn)，Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶催化反應(yīng)中存在一種高自旋的FeⅢ過氧化物中間體，而定義這種中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)對(duì)于理解該類酶的化學(xué)反應(yīng)是至關(guān)重要的。

未來(lái)有關(guān)Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶的研究工作不再局限于芳香烴有機(jī)污染物的降解，而是基于催化反應(yīng)的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向重要手性中間產(chǎn)物的合成。但是該酶系統(tǒng)的多組分復(fù)雜性、酶的不穩(wěn)定性、[2Fe-2S]中心的氧敏感性以及對(duì)昂貴的NAD(P)H的共底物需求都給酶促反應(yīng)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。然而Rieske型芳香環(huán)雙加氧酶在環(huán)境和化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力依然不容忽視，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)優(yōu)化和改造酶的功能特性，提高其生物催化活性，開發(fā)出適用于多種氧化反應(yīng)的、高效、環(huán)保、廉價(jià)的生物催化劑，仍是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。