喬聯(lián)橋，吳曉梅，席曉薇

作者單位：上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200080

卵巢惡性腫瘤是全世界女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，有研究顯示，化療耐藥是卵巢癌高死亡率的重要原因之一［1］。因此，尋找研發(fā)更加有效敏感的化療藥物，開發(fā)新的治療手段，對廣大卵巢癌病人有著深刻意義。

α-NETA（N，N，N-trimethyl-y-oxo-1-naphthalenepropanaminiumiodide）作為小分子化學(xué)藥物，是一種乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶抑制劑（Choline Acetyl Transferase，ChAT）（IC50＝9 μmol/L），一般用于神經(jīng)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室研究［2］，2017年有報道發(fā)現(xiàn)化療藥物與細(xì)胞凋亡之間存在相關(guān)關(guān)系［3］。研究發(fā)現(xiàn)其有發(fā)揮殺滅腫瘤細(xì)胞的新功能。β-arrestin2 是一類Arrestin家族成員，它不僅參與調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）的脫敏和內(nèi)化，還可以作為支架蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號通路［4-8］。有研究證實(shí)，β-arrestin 2 以及β-arrestin 1 具有抗細(xì)胞焦亡作用，同時β-arrestin 2 可以通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，如抑制NF-KB 活化、調(diào)節(jié)趨化因子受體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞趨化等，同時還與免疫系統(tǒng)疾病、炎癥、腫瘤等相關(guān)［4-8］。本研究自 2015年 1月至 2016年1月研究α-NETA 在上皮性卵巢癌細(xì)胞中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料 上皮性卵巢癌細(xì)胞株：HO8910 和Hey細(xì)胞株購買自美國ATCC 公司。Moody 從本實(shí)驗(yàn)室獲取。裸鼠BALB/c 經(jīng)上海市第一人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)動物中心申請獲取。細(xì)胞培養(yǎng)液采用DMEM（Dulbeccoo’s Modification of Eagle’s Medium Dulbecco）（購買于Gibco）加10%FBS 加1%雙抗生素。抗體anti-β-arrestin2，anti-GAPDH，α-NETA 購買于Abcam公司。

1.2 CCK8（Cell Counting Kit-8） 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至融合度約90%。胰酶消化細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液，約2×104～2×105/mL 左右。在96 孔板中鋪板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用DMEM空白培養(yǎng)基配制α-NETA 藥物濃度梯度液（5，25，12.5，6.25 μg/mL），更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加入藥物濃度梯度液，每孔100 μL。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h。向每孔加入10 μL CCK8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測定吸光度。

1.3 流式細(xì)胞死亡檢測 配制細(xì)胞懸液六孔板鋪板，保持細(xì)胞密度約70%，培養(yǎng)箱（37 ℃，5%二氧化碳）培養(yǎng) 24 h。根據(jù) IC50（half maximal inhibitory concentration）使用空白 DMEM 稀釋 α-NETA 母液，實(shí)驗(yàn)組三孔更換加入藥物的空白培養(yǎng)液，使用空白培養(yǎng)基設(shè)立三孔對照組。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h 后分別消化兩組細(xì)胞配制細(xì)胞懸液。按表1 設(shè)計加入Annexin V 與核酸染料。輕輕混勻，室溫避光放置15 min，1 h內(nèi)上機(jī)操作檢測。

記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)后統(tǒng)計分析作圖。

表1 流式細(xì)胞死亡檢測過程中加入試劑名稱

1.4 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn) 取15 只雌性免疫缺陷裸鼠（BALB/c）用于異種移植研究。每5只小鼠圈養(yǎng)在一個籠子中，每天12 h 晝夜交換模式，可以隨意獲取食物和無菌水。將α-NETA 溶于99.5%甲醇（上海世益化學(xué)品有限公司），用Opti-MEM（Gibco 31985070，USA）配制溶液為12.5μg/mL。使用PBS配制HO8910 細(xì)胞懸液，每只小鼠在左腋窩皮下注射約1×107HO8910 細(xì)胞。每日稱重小鼠并每隔一天測量腫瘤。腫瘤體積計算：瘤體積（mL）＝長×（寬）2×0.5。2周后，將15只小鼠隨機(jī)分成三組，（對照組，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2）。當(dāng)腫瘤達(dá)到≥0.15 mL的體積時，用藥物治療小鼠。實(shí)驗(yàn)組1（n＝5）每只小鼠每天注射50μLα-NETA工作溶液，對照組（n＝5）皮下注射與實(shí)驗(yàn)組相同濃度的載體液體。實(shí)驗(yàn)組2（n＝5）在1 周前以與對照組相同的方式進(jìn)行治療，并且在1 周后進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組1 相同的治療。根據(jù)倫理準(zhǔn)則，當(dāng)腫瘤達(dá)到2 mL體積或直徑超過2 cm時，處死動物，然后切除腫瘤。將腫瘤在冰箱中于-80 ℃冷凍。密切監(jiān)測小鼠的體重減輕和其他毒性跡象。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)將三組的統(tǒng)計學(xué)（腫瘤體積，腫瘤重量和小鼠體質(zhì)量）用于比較分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 和GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和制作圖表。數(shù)據(jù)采用表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-NETA 誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞死亡 圖1A所示為100 倍顯微鏡下殺滅效果。使用CCK8 對HO8910，Hey 和正常卵巢細(xì)胞株Moody 細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞毒性測定（圖1B）。同時，進(jìn)行IC50 計算：HO8910＝6.28 μg/mL，Hey＝26.34 μg/mL，Moody＝45.29 μg/mL（1 μm α-NETA＝369.24 mg；1 mg α-NETA＝0.27 μmol）。用濃度為12.5 μg/mL α-NETA 的空白培養(yǎng)基處理HO8910 24 h（與對照相同濃度的甲醇），并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行死亡率測定（圖1C）。α-NETA 組的死亡率46.8%遠(yuǎn)高于對照組的2.8%。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次以上的獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 α-NETA 可抑制體內(nèi)腫瘤生長 在免疫缺陷小鼠BALB/c 異種移植模型中檢測α-NETA 在體內(nèi)作用效果。HO8910細(xì)胞用于皮下腫瘤形成。通過瘤內(nèi)注射方式給藥。圖2A 為動物實(shí)驗(yàn)周期圖。圖2B示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組1（治療1周）和實(shí)驗(yàn)組2（治療2 周）的腫瘤體積（P＝0.007）和腫瘤重量（P＝0.004）都有所減少。Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)三組間比較，P＜0.01。α-NETA 使用濃度未觀察到小鼠中毒或者死亡現(xiàn)象。

圖1 α-NETA細(xì)胞學(xué)藥物毒性檢測：A為100倍顯微鏡下濃度12.5μg/mL α-NETA作用HO8910細(xì)胞24 h后實(shí)驗(yàn)組與對照組效果圖，B為對HO8910，Hey卵巢癌細(xì)胞株以及正常卵巢細(xì)胞株Moody進(jìn)行CCK8毒性檢測，C為流式細(xì)胞儀進(jìn)行死亡率測定

2.3 α-NETA 通過β-arrestin 2 介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞 將α-NETA 處理后的HO8910 細(xì)胞與對照組細(xì)胞進(jìn)行WB 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組HO8910 細(xì)胞βarrestin 2 表達(dá)增加（圖3A）。同樣檢測CMKLR1 的表達(dá)情況，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（數(shù)據(jù)未展示）。這表明β-arrestin 2作為一個與細(xì)胞膜表面的G蛋白偶聯(lián)受體CMKLR1 密切相關(guān)的蛋白參與了殺死腫瘤細(xì)胞的過程。同時，根據(jù)之前化療藥物與細(xì)胞焦亡相關(guān)的報道［3］，對α-NETA 處理后的上皮性卵巢癌細(xì)胞HO8910 進(jìn)行顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生有細(xì)胞焦亡相關(guān)的特征性大泡（圖3B）。

3 討論

本研究的開端起源于一個偶然的發(fā)現(xiàn)。α-NETA 是CMKLR1的一個新型抑制劑可以通過調(diào)節(jié)βarrestin2 抑制 CMKLR1 活性［2］。起初我們推測，CMKLR1被α-NETA處理后會可能會抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移，于是我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，但是我們發(fā)現(xiàn)用α-NETA 處理卵巢癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞停止生長，甚至死亡。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之后，發(fā)現(xiàn)這并非一個偶然現(xiàn)象。

圖2 α-NETA體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)：A為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)周期圖表。B為小鼠腫瘤離體照片，從上到下分別為對照組，治療組1（Treated/1 week），治療組2（Treated/2 week）。C為三組腫瘤體積的統(tǒng)計分析（P＝0.007）。D為三組腫瘤質(zhì)量的統(tǒng)計分析（P＝0.004）。Kruskal-Wallis檢驗(yàn)三組間比較，aP＜0.01

圖3 α-NETA殺滅腫瘤細(xì)胞相關(guān)通路探究：A為對α-NETA處理后細(xì)胞蛋白進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)WB檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組HO8910細(xì)胞較對照組β-arrestin 2表達(dá)增加，aP＜0.05，B為顯微鏡下200倍鏡像觀察，可見α-NETA處理組中有與細(xì)胞焦亡相關(guān)特征性大泡產(chǎn)生，見圖a，b，c右下角所示。對照組無相關(guān)現(xiàn)象（見圖d）

隨后，我們進(jìn)行了體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了特定濃度下α-NETA的抗腫瘤作用。但是對于每一個小分子化療藥物，不可避免地一個問題就是藥物的副作用表現(xiàn)，即毒性表現(xiàn)。我們通過小鼠活動力，體重等指標(biāo)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，α-NETA治療后的小鼠體重上升不明顯，而且實(shí)驗(yàn)組小鼠有弓背表現(xiàn)，雖然并未發(fā)現(xiàn)影響小鼠活力，但是我們推測α-NETA 還是存在一定的毒性或者是神經(jīng)性毒副作用。但是這并不能否定α-NETA作為一個新型抗腫瘤小分子化學(xué)藥物的可能性。

更進(jìn)一步地，我們在細(xì)胞死亡通路研究檢測中發(fā)現(xiàn)了β-arrestin2 的差異表達(dá)，在之前文獻(xiàn)報道中有提及，α-NETA可以通過調(diào)節(jié)β-arrestin2在細(xì)胞膜內(nèi)富集與CMKLR1細(xì)胞膜內(nèi)羧基末端結(jié)合，從而導(dǎo)致CMKLR1，G蛋白偶聯(lián)受體的失活。α-NETA在此過程中扮演了G 蛋白偶聯(lián)受體的配體，替代chemerin 與其產(chǎn)生競爭與CMKLR1 結(jié)合發(fā)揮作用。該細(xì)胞通路被此前文獻(xiàn)證明確實(shí)是存在的［9］，但是該通路的作用僅僅是被證明是抑制腫瘤細(xì)胞遷移，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用?？傊?，本課題研究發(fā)現(xiàn)了β-arrestin2 可能參與了細(xì)胞死亡，之前有文獻(xiàn)報道過Arrestin家族蛋白參與抑制細(xì)胞凋亡［4-8］。但同時也有文獻(xiàn)報道化療藥物所致細(xì)胞死亡屬于細(xì)胞焦亡［3］。所以，本課題要完全確定α-NETA 介導(dǎo)細(xì)胞死亡是哪種細(xì)胞死亡方式，還需要后續(xù)深入研究。但是，α-NETA作為小分子化學(xué)藥物，其發(fā)揮的抗腫瘤細(xì)胞的新功能，是具有一定的臨床意義與研究價值的。