陳桂江，劉曉霖，王新雨

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東 廣州510663；2.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣東 廣州 510663；3.廣東羅浮山國藥股份有限公司，廣東 惠州 516133)

雞眼草為豆科植物雞眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindi.的干燥全草，始載于《救荒本草》，又名掐不齊、人字草、三葉人字草等，分布廣泛，資源豐富。其味微苦，性涼，為民間用藥，具有涼血解毒、清熱解表、散瘀消積等功效[1-2]，主治胃腸炎、痢疾、肝炎、夜盲癥、泌尿系統(tǒng)感染等[3-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[7]表明，雞眼草具有抗炎、抗病毒、殺菌、抗腫瘤作用等。其主要含有黃酮類成分，另外含有氨基酸、多糖、多酚等[8]，其中異葒草苷具有多種藥理活性，如抗氧化、抑制炎癥發(fā)展、改善胰島素抵抗、弱化肝纖維化發(fā)展以及誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡等作用[9]，木犀草素、木犀草苷具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種藥理作用[10-11]，染料木苷及染料木素具有改善女性更年期綜合征、抗腫瘤、改善心肌缺血、調(diào)節(jié)代謝綜合征、抗炎和細胞保護等藥理活性[12-13]。因此，該藥材具有重要的開發(fā)價值。

目前，有關(guān)雞眼草含量測定的文獻報道較少，且測定成分較為單一[14-15]，不能較全面地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。為了建立一種既能比較完善表達雞眼草的整體性特征，又有別于化學(xué)藥單一成分定量的質(zhì)量控制模式，本文采用HPLC法對雞眼草中異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素6種主要有效成分同時進行檢測，比較根、莖、葉中該6種主要有效成分含量的高低。該方法可為雞眼草質(zhì)量的綜合評價及臨床使用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，包含DAD檢測器、柱溫箱、四元泵、自動進樣器、OpenLAB CDS色譜工作站；SHZ-IIIA循環(huán)水多用真空泵(西安莫吉娜儀器制造公司)；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。Milli-Q純水儀(德國密理博公司)；ThermoStable SOV-20真空干燥箱(韓國大韓公司)。

1.2 試劑與藥材

甲醇(批號I0890607719，默克HPLC級)；甲酸(批號C10106313，麥克林HPLC級)；異葒草素標準品(批號M74818074，純度≥98%，麥克林)；異牡荊素標準品(批號20160706，純度≥98%，寶雞辰光生物)；染料木苷(純度≥98%，上海中藥標準化研究中心)；木犀草苷(批號16052307，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；染料木素(批號HG031193198，純度≥98%，寶雞辰光生物技術(shù)有限公司)；木犀草素(批號HL0906100198，純度≥98%，寶雞辰光生物技術(shù)有限公司)。藥材購買于廣東省揭陽，經(jīng)廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院許友毅副教授鑒定該藥材為豆科植物雞眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindi.的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent SB-AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。流動相：0.1%甲酸(A)，0.1%甲酸甲醇溶液(B)，洗脫梯度：0～20 min，64% A；20～35 min，64%～69% A；35～40 min，69%～67% A；40～50 min，67% A；50～60 min，67%～47% A；60～70 min，47%～40% A；70～80 min，40%～30% A。流速：0.8 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：260 nm、350 nm，進樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品儲備液 分別精密稱取異葒草素對照品10 mg、異牡荊素對照品10 mg、染料木苷對照品10 mg、木犀草苷對照品10 mg、染料木素對照品10 mg、木犀草素對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解，70%甲醇溶液稀釋、定容成1 mg/mL的對照品儲備液。分別精密量取上述溶液2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，配制成0.1 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液 取雞眼草約1 g，精密稱定，加70%甲醇溶液50 mL，浸泡60 min，超聲60 min。提取液于50 ℃真空減壓干燥箱濃縮，用甲醇定容至10 mL。

2.2.3 空白溶液 取70%甲醇溶液作為空白溶液。

2.3 專屬性試驗

取空白溶液、35 μg/mL混合對照品溶液、雞眼草(全草)溶液10 μL，分別進樣得色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液在對照品溶液相對應(yīng)的位置上沒有出現(xiàn)色譜峰，表明空白溶液無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察、檢測限和定量限

取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液作為1 000 μg/mL的標準曲線溶液，分別精密量取“2.2.1”項下對照品儲備液2.5、1、0.5、0.25、0.05、0.025 mL，置于5 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度；分別精密量取“2.2.1”項下對照品儲備液0.25、0.05、0.025 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度；將上述所有溶液作為系列濃度的混合對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件分析，記錄峰面積積分，以峰面積積分(Y)為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸。結(jié)果見表1。

1.異葒草素；2.異牡荊素；3.染料木苷；4.木犀草苷；5.染料木素；6.木犀草素

取100 μg/mL對照品混合溶液，置于容量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋定容，以S/N值≥3為檢測限，S/N值≥10為定量限。結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品儲備液0.25 mL，置于5 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，同法配制6份溶液，按上述色譜條件進樣，測定其峰面積，計算RSD值。結(jié)果表明，異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面積積分RSD分別為0.10%、0.11%、1.49%、0.32%、0.09%、0.01%，表明試驗方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同批號的6份雞眼草(全草)，按照“2.2.2”項下方法，制備雞眼草溶液，按相應(yīng)色譜條件進樣，測定其峰面積積分，計算RSD值。結(jié)果表明，異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面積積分RSD分別為3.61%、1.61%、1.17%、1.24%、2.91%、2.80%，表明試驗方法精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已測6種有效成分含量的雞眼草約1 g，精密稱定，按高、中、低濃度分別加入一定量的對照品，按照“2.2.2”項下操作，制備成加樣回收率供試液，并依法測定，結(jié)果見表2。

表1 標準曲線和檢測限、定量限 (n=3)

表2 雞眼草中6種主要有效成分的加樣回收率試驗結(jié)果 (n=3)

續(xù)表2

異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素在高、中、低濃度下的回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，表明分析方法符合要求。

2.8 穩(wěn)定性實驗

取全草供試品溶液，分別于放置0、3、6、9、12、15、24 h后按照上述色譜條件進樣，測定其峰面積積分，計算RSD值。結(jié)果表明，異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素峰面積積分RSD分別為0.17%、0.12%、1.37%、0.33%、0.14%、0.15%，表明樣品溶液在試驗條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品含量測定

分別取同一批號的雞眼草全草、根、莖、葉約1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，各平行制備6份，分別測定異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中6種有效成分含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，異紅草素、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素在葉片中含量最高，莖次之，根中含量最低；染料木苷在莖中含量較高，根次之，葉片中幾乎未能檢測到。染料木素在根中含量最高，莖次之，葉片中幾乎未能檢測到。

3 討論

3.1 檢測成分的選擇

雞眼草中含有葒草素、異葒草素、染料木苷、異牡荊素、木犀草苷、染料木素、木犀草素、槲皮素、蘆丁、山奈酚、芹菜素等多種有效成分[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞眼草中葒草素含量較低，且在該實驗中分離度不好，因此，未對其進行定量。此外，該研究中未檢測到山奈酚、芹菜素、槲皮素和蘆丁。在該試驗條件下，木犀草素和槲皮素出峰時間相同，但二者的最大吸收波長不同，槲皮素的最佳吸收波長為374 nm、254 nm，而木犀草素為350 nm、254 nm，通過觀察3D圖譜可知，樣品中含有的是木犀草素，而不是槲皮素。因此，本研究對異葒草素、染料木苷、異牡荊素、木犀草苷、染料木素、木犀草素6種成分進行了定量。

3.2 提取條件的優(yōu)化

處理樣品時，比較了50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果。發(fā)現(xiàn)50%甲醇與70%甲醇的提取物雜質(zhì)峰較多；甲醇與乙醇提取時，雜質(zhì)峰較少，但是乙醇提取時，異葒草素及異牡荊素的峰面積相對減少，最終選擇了甲醇作為提取溶劑。在制備供試品溶液時，考察了連續(xù)回流提取法和超聲提取法的提取效果，結(jié)果表明兩種提取方法對該6種成分峰面積無明顯影響，但是超聲提取操作簡便，因此選擇超聲提取法制備供試品溶液。超聲提取制備供試品溶液時，考察了超聲時間30 min、60 min、90 min的提取效果，結(jié)果表明超聲提取30 min時，各峰的峰面積均較小；超聲提取60 min與90 min時，各成分的峰面積無顯著差異，因此，選擇了超聲提取60 min制備供試品溶液。

3.3 色譜條件的選擇

異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、染料木素、木犀草素6種成分均為黃酮類化合物，對6種成分在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，染料木苷和染料木素的最佳吸收波長為260 nm，異葒草素、異牡荊素、染料木苷、木犀草苷、木犀草素的最佳吸收波長350 nm，且各吸收峰的峰面積、峰形及分離度等指標較為理想，故選定260 nm和350 nm進行雙波長檢測。對中藥復(fù)方制劑多指標組分進行同時測定，流動相體系的篩選尤為關(guān)鍵，根據(jù)所測指標性成分的理化性質(zhì)和色譜行為，比較了以甲醇-水、甲醇-0.5%甲酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液、0.1%甲酸-0.1%甲酸甲醇溶液為流動相，分別進行梯度洗脫的效果。采用乙腈-0.5%甲酸作為流動相梯度洗脫時，異牡荊素、木犀草苷重疊為一個峰，難以分開。采用0.1%甲酸-0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相梯度洗脫時，可將二者分開，分離度達到要求，其余4種成分色譜峰的分離度和理論塔板數(shù)也均能達到要求。

4 結(jié)論

本研究采用HPLC同時測定雞眼草中6種主要有效成分的含量，該方法靈敏度高、專屬性強，所用流動相系統(tǒng)和預(yù)處理方法簡便，能較好地控制雞眼草的質(zhì)量。該6種成分在雞眼草根、莖、葉、全草的不同藥用部位中含量差異較大，異葒草素、異牡荊素、木犀草素在葉中含量較高，染料木苷在莖中含量較高，染料木素在根中含量較高，并且葉中未能檢測到染料木苷、染料木素，該結(jié)果可為雞眼草的炮制及臨床用藥提供參考依據(jù)。