張婷婷 陳濤 李燕莉 楊漫漫 魏強(qiáng) 王然 李林 李勇

摘要：利用國(guó)際上最新的兩種基于CRISPR/Cas9的BE3（Cytosine base editor，CBE）和ABE7.10（Adenine base editor，ABE）單堿基修飾技術(shù)對(duì)豬基因組靶基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯效率的分析研究。設(shè)計(jì)、合成并構(gòu)建4個(gè)豬基因組靶基因位點(diǎn)gRNA表達(dá)載體，分別與CBE或ABE共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定單堿基替換效率和indels發(fā)生率。結(jié)果表明，單堿基編輯系統(tǒng)BE3和ABE7.10對(duì)豬基因組靶位點(diǎn)堿基修飾的活性編輯窗口主要分別為5個(gè)核苷酸和4個(gè)核苷酸;兩套單堿基編輯系統(tǒng)主要對(duì)編輯窗口內(nèi)的目標(biāo)堿基進(jìn)行單堿基轉(zhuǎn)換而非indel;兩套單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)豬基因組堿基置換有一定偏好性，其中CMAH、MC1R（1-2）、MC1R（2-1）基因編輯窗口內(nèi)C→T的效率分別為2.2%、0.4%和1.3%;豬GGTA、MSTN-2窗口內(nèi)A→G的效率分別為1.4%、1.4%。表明單堿基編輯系統(tǒng)BE3和ABE7.10均能夠?qū)ωi細(xì)胞的基因組靶位點(diǎn)序列進(jìn)行有效的單堿基置換。

關(guān)鍵詞：豬;單堿基編輯;CRISPR/Cas9;BE3;ABE7.10

中圖分類(lèi)號(hào)：Q812? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）18-0143-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.029 開(kāi)

Programmable base editing efficiency study of CRISPR/Cas9-guided

DNA base editors in pig genome

ZHANG Ting-ting1，2， CHEN Tao2，3， LI Yan-li1，2， YANG Man-man2，3，

WEI Qiang2，3， WANG Ran2，3，LI Lin2，3， LI Yong1，2，3

（1. BGI-Shenzhen Sanshengyuan Technology Co.， Ltd.， Shenzhen? 518000， Guangdong， China;

2. BGI-Agricultural Application Research Institute， Shenzhen? 518000，Guangdong，China;

3.Shenzhen Engineering Laboratory for Genomics-Assisted Animal Breeding， Shenzhen? 518000， Guangdong，China）

Abstract： The CRISPR/Cas9-based BE3（Cytosine base editor，CBE） and ABE7.10（Adenine base editor，ABE） were used to analyze and study the editing efficiency of target gene loci in pig genome. Four porcine genomic target gene loci gRNA expression vectors were designed， synthesized and constructed， which were co-transfected into PK15 cells with CBE or ABE， respectively. The PK15 cells were further cultured for 48 h， and single-base replacement efficiency and indels incidence were determined by second-generation sequencing technology. The results showed that the active editing Windows of the single base editing system BE3 and ABE7.10 were 5 nucleotides and 4 nucleotides， respectively; Both BE3 and ABE7.10 were mainly contributed to single base conversion but not indel; The two sets of single-base editing systems showed certain preference for base replacement in pig genome. In the CMAH， MC1R（1-2） and MC1R（2-1） gene editing Windows， the efficiency of C→T was 2.2%， 0.4% and 1.3%， respectively; The efficiency of A→G in pig GGTA and MSTN-2 was 1.4% and 1.4%， respectively. It is shown that both BE3 and ABE7.10 can perform effective single base substitutions for genomic target sequences in pig cells.

Key words： pig; single base editing; CRISPR/Cas9; BE3; ABE7.10

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）-associated system，Cas9）系統(tǒng)作為第三代基因編輯工具已廣泛應(yīng)用于各物種的基因修飾，包括小鼠[1]、豬[2]、牛[3]、羊[4]、水稻[5]、擬南芥[6]、煙草[7]、玉米[8]、小麥[9]等。該系統(tǒng)是在sgRNA的引導(dǎo)下Cas9核酸酶造成基因組雙鏈斷裂，斷裂后的基因組進(jìn)行非同源末端修復(fù)（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源末端修復(fù)（Homology-directed repair，HDR）來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯。絕大部分DNA修復(fù)是通過(guò)NHEJ的方式進(jìn)行，這種修復(fù)通常會(huì)產(chǎn)生大量的小片段隨機(jī)插入或缺失，抑或造成大片段缺失，進(jìn)而導(dǎo)致基因的失活[10]。然而，在現(xiàn)實(shí)的農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，導(dǎo)致農(nóng)藝性狀或人類(lèi)遺傳性疾病的原因則更多的是因點(diǎn)突變引起的功能獲得或缺失，如約2/3的人類(lèi)遺傳疾病都是由單堿基突變?cè)斐桑@種單堿基突變卻是常規(guī)CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)雙鏈斷裂所不能完成的。盡管通過(guò)同源重組載體或ssDNA介導(dǎo)的HDR完成，但由于細(xì)胞內(nèi)同源重組的發(fā)生概率極低[11]，使得這類(lèi)堿基替換方法的效率極低。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的單堿基替換技術(shù)較多。利用Cas9突變體（nCas9）分別與大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC）融合，開(kāi)發(fā)出在DNA雙鏈不發(fā)生斷裂的情況下可以實(shí)現(xiàn)更加安全、高效、精準(zhǔn)的單堿基編輯器（Cytosine base editor， CBE），而且其效率遠(yuǎn)高于DSB引起的HDR修復(fù)方式[12]。Gaudelli等[13]把Escherichia coli來(lái)源的tRNA腺苷酸脫氨酶（TadA）與nCas9融合，經(jīng)過(guò)多輪選擇和蛋白修飾后，開(kāi)發(fā)出可以將腺嘌呤精準(zhǔn)地轉(zhuǎn)化成鳥(niǎo)嘌呤的新型單堿基轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Adenine base editor， ABE）。且隨著生物技術(shù)的發(fā)展，形成了更多高效特異的單堿基替換系統(tǒng)[14，15]。目前，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的單堿基替換系統(tǒng)BE3和ABE7.10已在小鼠[16]、斑馬魚(yú)[17]、人類(lèi)干細(xì)胞[18]、水稻[19]、小麥[20]等物種中得到廣泛應(yīng)用。

豬作為中國(guó)最為重要的農(nóng)業(yè)動(dòng)物，因其與人在解剖、生理、病理以及基因組序列方面高度的相似性，已成為人類(lèi)相關(guān)疾病研究的理想試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃彤惙N器官移植模型。現(xiàn)已通過(guò)改造豬基因組開(kāi)發(fā)了一系列的人類(lèi)疾病模型豬，如內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄病毒敲除模型[21]、亨廷頓舞蹈癥模型[22]、動(dòng)脈粥樣硬化模型[23]、杜氏營(yíng)養(yǎng)不良模型等[24]，以及伴隨單堿基替換系統(tǒng)而制備出的模擬人類(lèi)點(diǎn)突變的疾病模型豬[25，26]。

鑒于單堿基替換系統(tǒng)技術(shù)所具備的應(yīng)用價(jià)值，而該技術(shù)豬基因組編輯中卻沒(méi)有關(guān)于活性編輯框、單個(gè)堿基替換效率、堿基替換傾向性及脫靶等方面的報(bào)道。本研究選取了豬基因組中4個(gè)不同的基因作為靶位點(diǎn)，構(gòu)建其對(duì)應(yīng)的gRNA表達(dá)載體，以最新發(fā)展起來(lái)且應(yīng)用廣泛的單堿基替換系統(tǒng) BE3和ABE7.10為介質(zhì)，并結(jié)合靶向基因組測(cè)序技術(shù)，評(píng)價(jià)豬基因組特定序列的堿基替換結(jié)果。同時(shí)，選用4條人源序列開(kāi)展平行性陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，詳細(xì)對(duì)比分析了兩項(xiàng)基于CRISPR/Cas9技術(shù)的BE3和ABE7.10單堿基編輯技術(shù)在豬細(xì)胞基因組中的修飾效率和缺失、插入效率。本研究成果將為后續(xù)利用單堿基編輯系統(tǒng)在模型豬體內(nèi)研究、治療人類(lèi)單點(diǎn)突變疾病提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及載體 PK15細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物寄存庫(kù)（ATCC）;293T細(xì)胞由深圳國(guó)家基因庫(kù)母嬰健康研究中心楊熹提供;CRR質(zhì)粒由深圳華大三生園科技有限公司實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成;pCMV-ABE7.10質(zhì)粒、pCMV-BE3質(zhì)粒購(gòu)于Addgene。

1.1.2 主要試劑 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Omega公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司;MGIEasy DNA文庫(kù)快速制備試劑盒購(gòu)于深圳華大智造科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計(jì)及活性鑒定 4條陽(yáng)性對(duì)照sgRNA-2TAT、sgRNA-HBG1、sgRNA-EMX1、sgRNA- HEK293T site3序列均來(lái)自于文獻(xiàn)[12]和[13]。設(shè)計(jì)并合成豬GGTA、MSTN、CMAH、MC1R、MYH7等5個(gè)基因的sgRNA序列，sgRNA序列信息見(jiàn)表1。sgRNA正向鏈及其互補(bǔ)鏈按照體積比1∶1變性退火（變性退火程序：95 ℃，10 min;25 ℃，30 min），形成帶有黏性末端的雙鏈核苷酸，與經(jīng)BsaI酶切、膠回收純化后的CRR骨架載體連接。構(gòu)建的CRR表達(dá)載體經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證連接正確后，無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞驗(yàn)證剪切活性。

CRR-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒與pCMV-spCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，當(dāng)PK15細(xì)胞匯合度50%時(shí)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集細(xì)胞并提取基因組DNA（Genomic DNA，gDNA），PCR擴(kuò)增sgRNA靶點(diǎn)附近序列，產(chǎn)物經(jīng)T7程序變性退火后用T7核酸內(nèi)切酶I酶切，sgRNA活性鑒定引物見(jiàn)表2，反應(yīng)體系如下。

PCR反應(yīng)體系：gDNA 0.1 μg，premix Ex Taq 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s，55～62 ℃（Tm）退火30 s，72 ℃延伸10 s，32個(gè)循環(huán);再于72 ℃延伸2 min;4 ℃保存。

T7變性程序：95 ℃預(yù)變性10 min;以2.0 ℃/s自95 ℃降至85 ℃;以-0.3 ℃/s 自85 ℃降至25 ℃;25 ℃ 1 min。

T7酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物18 μL，NEB? ? ? Buffer2 2 μL，T7核酸內(nèi)切酶I 0.2 μL。反應(yīng)條件37 ℃，45 min。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PK15細(xì)胞、293T細(xì)胞復(fù)蘇至24孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)50%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染策略見(jiàn)表3。DNA轉(zhuǎn)染總量500 ng，單堿基替換載體和CRR-sgRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染比例為3∶1。根據(jù)脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24 h更換1次培養(yǎng)基。

1.2.3 靶向文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，提取基因組DNA，靶向擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：gDNA 5 ng，PrimeSTAR 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s，55～60 ℃（Tm）退火30 s，72 ℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán);再于72 ℃延伸2 min;4 ℃保存。靶向擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表4。

取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，剩余產(chǎn)物純化后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

使用Qubit？ dsDNA HS Assay Kit檢測(cè)PCR回收產(chǎn)物濃度，均一化至60 ng/μL，總體積50 μL，使用MGIEasy DNA文庫(kù)快速制備試劑盒進(jìn)行文庫(kù)制備。文庫(kù)環(huán)化產(chǎn)物使用Qsep100檢測(cè)片段長(zhǎng)度，Qubit？ ssDNA Assay Kit測(cè)定濃度，使用BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行PE100測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)使用SOAPnuke-1.5.0進(jìn)行過(guò)濾，使用BWA-0.7.12進(jìn)行序列比對(duì)，用Samtools1.7的mpileup模塊轉(zhuǎn)換格式后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRR-sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建及活性驗(yàn)證結(jié)果

將豬靶基因GGTA、MSTN、CMAH、MC1R、MYH7相關(guān)sgRNA，陽(yáng)性對(duì)照2TAT、HBG1、EMX1、HEK293T site3相關(guān)sgRNA，分別連入CRR骨架載體中，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，表明sgRNA均成功連接到CRR骨架載體中（圖1）。

將構(gòu)建成功的豬靶基因相關(guān)sgRNA表達(dá)載體與pCMV-spCas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后提取基因組DNA，用鑒定引物擴(kuò)增并進(jìn)行T7酶切鑒定，活性鑒定結(jié)果表明，7條豬靶基因相關(guān)的sgRNA均有剪切活性，其中MSTN-1活性較弱（圖2）。

2.2 靶向文庫(kù)構(gòu)建

靶向擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增靶向位點(diǎn)及其附近序列，陽(yáng)性對(duì)照及樣品平行擴(kuò)增3份，電泳結(jié)果（圖3）顯示，目的片段大小正確，樣品目標(biāo)條帶單一、特異性較好。

2.3 單堿基替換效率分析

BE3單堿基編輯系統(tǒng)中的胞嘧啶脫氨酶的酶活性窗口包含了5個(gè)核苷酸，一般是距離PAM序列最遠(yuǎn)端的第4至第8個(gè)核苷酸[12]。對(duì)靶序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4A至圖4F）顯示，CMAH、MC1R（1-2）、MC1R（2-1）、陽(yáng)性對(duì)照HEK293Tsite3的堿基替換主要發(fā)生在活性編輯窗口內(nèi)，其中CMAHC5→T5效率為2.2%（圖4A），MC1R（1-2）C7→T7效率為0.4%（圖4B）;MC1R（2-1）C7→T7效率為1.3%（圖4C），陽(yáng)性對(duì)照HEK293T site3 C4→T4和C5→T5的效率分別為11%和10%（圖4E）。相比而言，另一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照EMX1基因窗口區(qū)堿基替換效率極低，C6→T6效率僅為0.02%（圖4D）。

ABE7.10單堿基編輯系統(tǒng)中的腺嘌呤脫氨酶的酶活性窗口包含了4個(gè)核苷酸，一般是距離PAM序列最遠(yuǎn)端的第4至第7個(gè)核苷酸[13]。對(duì)靶序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5A至圖5F）顯示，樣品GGTA和MSTN-2、陽(yáng)性對(duì)照2TAT和HBG1其堿基替換主要發(fā)生在活性編輯窗口內(nèi)，其中GGTA A7→G7的效率為1.4%（圖5A），MSTN-2 A6→G6的效率為1.4%（圖5C），2TAT A5→G5效率為9.6%（圖5D），HBG1A7→G7的效率為1.2%（圖5E）。相比而言，MSTN-1的單堿基修飾效率極低，窗口區(qū)A→G效率僅為0.01%（圖5B）。

鑒于單堿基修飾系統(tǒng)極低的indels發(fā)生率，同時(shí)設(shè)計(jì)了常規(guī)CRISPR/Cas9的對(duì)照，并通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)indels發(fā)生率，結(jié)果（圖4F、圖5F）顯示，除陽(yáng)性對(duì)照HEK293T site3有2.2%的indels比例外，其他組都遠(yuǎn)低于常規(guī)CRISPR/Cas9組，這說(shuō)明單堿基編輯后的樣品主要發(fā)生堿基替換。

3 討論

單堿基修飾是近年來(lái)發(fā)展最為迅速的基因編輯技術(shù)之一，它整合了Cas9蛋白的靶向性和脫氨酶堿基替換修復(fù)的特點(diǎn)，為農(nóng)業(yè)或生物醫(yī)學(xué)單點(diǎn)、多點(diǎn)特定堿基定向突變模型制備提供了高效的技術(shù)手段[20，27-29]。本研究利用BE3和ABE7.10兩套單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)4個(gè)豬基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行單堿基修飾。結(jié)果表明，BE3和ABE7.10兩套單堿基編輯系統(tǒng)都能對(duì)豬靶基因進(jìn)行有效的單堿基修飾，且堿基轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在活性編輯窗口內(nèi)，這與該基因編輯系統(tǒng)在其他物種中的報(bào)道類(lèi)似。只不過(guò)在本研究中單堿基替換效率較低，4個(gè)豬靶基因區(qū)域堿基修飾最高比例僅有2.2%，略低于其他文獻(xiàn)報(bào)道中的轉(zhuǎn)換效率[12，13]。但是在同等試驗(yàn)條件下，在人293T細(xì)胞中對(duì)4個(gè)基因受BE3和ABE7.10作用而發(fā)生單堿基修飾的效率也偏低，整體而言，以此作對(duì)照并不影響本研究關(guān)于活性編輯框、單個(gè)堿基替換效率、堿基替換傾向性在豬和人基因組中進(jìn)行差異比較與分析的結(jié)果。此外，BE3-MC1R（1-2）位點(diǎn)、BE3-EMX1位點(diǎn)以及ABE7.10-MSTN-1未能發(fā)生單堿基修飾可能與gRNA活性有關(guān)，沒(méi)有加入單堿基編輯效率的數(shù)據(jù)分析之中。本研究發(fā)現(xiàn)，BE3系統(tǒng)堿基替換效率整體略高，ABE7.10的要低些。大量研究表明，體外基因編輯效率與細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高度正相關(guān)，無(wú)論是核轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染或者通過(guò)病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，都能實(shí)現(xiàn)高效的載體導(dǎo)入，從而獲得高效的基因編輯結(jié)果[30-32]。

CBE和ABE堿基編輯系統(tǒng)都能夠在不使DNA雙鏈斷裂的情況下，精準(zhǔn)、高效地進(jìn)行目標(biāo)堿基的替換，精確地生成或者修復(fù)點(diǎn)突變。這在本研究中也有體現(xiàn)，以MYH7和MSTN為靶點(diǎn)測(cè)定了CRISPR/Cas9基因修飾發(fā)生的indel概率為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)BE3和ABE7.10單堿基編輯系統(tǒng)編輯后，除HEK293T site3有2.2%的indels比例外，其他組indels都在1.0%以下，編輯產(chǎn)物indels的發(fā)生率都比CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯產(chǎn)物indels的發(fā)生率低，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符合[12，13]。此外，本研究中樣品以及陽(yáng)性對(duì)照都出現(xiàn)了不同程度的編輯窗口以外的堿基轉(zhuǎn)換，結(jié)合在小鼠、豬等多個(gè)物種中進(jìn)行的多項(xiàng)研究[16，25，26，33]顯示，CBE編輯系統(tǒng)用于堿基轉(zhuǎn)換時(shí)，除了目標(biāo)堿基C-T轉(zhuǎn)換的同時(shí)還會(huì)伴隨著少量的C-A或C-G的轉(zhuǎn)換。鑒于CBE堿基編輯系統(tǒng)中所用的酶是突變體dCas9，一種缺乏雙鏈斷裂能力的核酸酶，可以排除Cas9斷裂雙鏈DNA后引起indels，推測(cè)是當(dāng)編輯窗口內(nèi)的堿基脫氨基以及堿基切除修復(fù)時(shí)，把目標(biāo)堿基做轉(zhuǎn)換的同時(shí)引發(fā)了堿基的插入或缺失[27]。

在位點(diǎn)活性評(píng)價(jià)方面，與常規(guī)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)依賴T7酶檢測(cè)不同，單堿基編輯系統(tǒng)主要通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)檢測(cè)堿基替換比率。本研究發(fā)現(xiàn)采用靶向PCR建庫(kù)的方法可以較為高效地檢測(cè)低頻堿基變異，利用該方法最重要的是確保擴(kuò)增片段的特異性和高保真性。此外，在建庫(kù)過(guò)程中，接頭連接時(shí)容易發(fā)生片段自連，從而產(chǎn)生非特異性條帶，但這些條帶在建庫(kù)后純化中可去除，不會(huì)影響后續(xù)的測(cè)序。最后，相比高通量測(cè)序一個(gè)反應(yīng)上百GB的數(shù)據(jù)而言，靶向片段的測(cè)序數(shù)據(jù)極少，可以與其他類(lèi)型的測(cè)序樣本進(jìn)行pooling來(lái)降低檢測(cè)成本。

總之，本研究利用基于CRISPR/Cas9技術(shù)的BE3和ABE7.10兩套單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)PK15細(xì)胞中4種不同基因靶位點(diǎn)進(jìn)行了研究，探索這兩套堿基修飾系統(tǒng)對(duì)豬基因組堿基的編輯情況以及編輯效率。結(jié)果表明，BE3和ABE7.10系統(tǒng)都能在體外試驗(yàn)中對(duì)豬基因組中靶基因產(chǎn)生一定的編輯效果，這將為科研工作者研究基因在豬細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能、為創(chuàng)制人類(lèi)單堿基突變基因病的小型豬動(dòng)物模型提供重要生物技術(shù)基礎(chǔ)。

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