林曉蒙 余柯娜 蔡旭東

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是威脅全人類健康的慢性疾病之一，最新調(diào)查顯示：2017年全球CKD 患病率估計為9.1%，近五分之一的患者生活在中國（約1.32 億例）[1]。腎間質(zhì)纖維化是CKD進(jìn)展的病理基礎(chǔ)及最終結(jié)局，早期預(yù)防，即在腎臟纖維化開始形成的初期加以干預(yù)，可延緩CKD 進(jìn)程，甚至避免患者進(jìn)入終末期腎臟病。腎間質(zhì)纖維化是多因素參與的復(fù)雜過程，其直接原因即是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與降解失衡，過度堆積的ECM 破壞了腎臟正常的功能結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腎功能失代償[2]。Ⅰ型及Ⅲ型膠原（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）是ECM 的主要成分，可作為觀察RIF 程度和治療情況的指標(biāo)[3]。腎間質(zhì)纖維化目前治療手段有限，應(yīng)用于臨床的主要是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB），作用有限，且存在一定的副作用，如高血鉀、影響腎小球?yàn)V過率等，中醫(yī)藥在腎纖維化治療方面有良好療效。溫陽消癥方是國家級名老中醫(yī)張沛虬老先生治療CKD 的經(jīng)驗(yàn)方，前期已證明在CKD 患者中辨證使用溫陽消癥方（文獻(xiàn)中溫陽化瘀方即溫陽消癥方），可改善血肌酐、腎小球?yàn)V過率、尿蛋白等指標(biāo)及患者臨床癥狀[4]，同時我們發(fā)現(xiàn)該方可改善腎纖維化模型小鼠的腎功能及腎臟病理[5-6]，本研究擬通過觀察溫陽消癥方對單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型小鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白和mRNA 表達(dá)的影響，來探討該方能否減輕腎間質(zhì)ECM 堆積，減輕腎間質(zhì)纖維化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 SPF 級C57 小鼠32 只，6～8 周齡，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號2008001658582，許可證號SCXK（滬）2013-0016。實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng)，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，恒溫25℃，12h 照明，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后造模。動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》要求。本研究經(jīng)所屬單位倫理委員會審核通過，審批號：SZY2017020041。

1.2 藥 物 溫陽消癥組（溫陽消癥方）：黃芪、黨參各30g，仙靈脾、肉蓯蓉各15g，桃仁12g，川芎15g，莪術(shù)30g，由上海曙光醫(yī)院中藥房提供。藥材加10 倍量水，浸泡2h，煎煮3 次，每次1h，合并水煎液，濃縮成含生藥4.9g/mL 水煎液備用。纈沙坦組（纈沙坦膠囊，商品名：代文），由北京諾華制藥有限公司提供，批號X2743，規(guī)格：80mg。

1.3 主要試劑及儀器 實(shí)時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Rt-qPCR）：Universal Reverse Transcription Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（LR-0103B，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），ComSYBR qPCR Mix（with ROX）熒光定量試劑盒（LK-0107BB，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），新鮮動物組織和細(xì)胞總RNA 抽提試劑盒（LN-0108B，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），MX3000P 實(shí)時熒光定量PCR 儀（德國Agilent 公司）。蛋白免疫印跡法（Western blot）：SuPer-GL ECL超敏發(fā)光液、裂解液（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），PVDF 轉(zhuǎn)移膜（美國MilliPore 公司），HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 及HRP-conjugated goat anti-mouse IgG（美國Jakeson 公司），PowerPacTMHC電泳儀、Semi-Dry Transfer Cell、轉(zhuǎn)膜濾紙（美國biorad 公司），VE-180 垂直電泳槽（浙江天能公司），DY-B1 脫色搖床（上海青浦滬西儀器），KODAK XOmat BT Film 及X 光片顯影液、X 光片定影液（美國Kodak 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物造模及分組 32 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、溫陽消癥組、纈沙坦組，每組8 只，建立UUO 模型[7]，方法如下：小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉，在左側(cè)肋骨下方約1cm 處行縱向切口，長約0.8～1.0cm，逐層分離皮膚、皮下組織及肌層，暴露左腎及左側(cè)輸尿管，將左側(cè)輸尿管分離，予手術(shù)線進(jìn)行雙重結(jié)扎，不剪斷，最后逐層縫合。假手術(shù)組開腹后不予結(jié)扎輸尿管，單純分離左側(cè)輸尿管后直接縫合。

2.2 給藥方法及取材 造模后溫陽消癥組以人鼠藥物劑量20 倍[8]換算后制成4.9g/mL 溫陽消癥方水煎劑，小鼠給藥劑量49g/kg；纈沙坦組以人鼠藥物劑量12.33 倍[9]換算后制成1.65mg/mL 水懸液，小鼠給藥劑量16.5mg/kg；假手術(shù)組及模型組予等容量生理鹽水每天0.2mL 灌胃，療程共2 周。治療2 周后處死各組小鼠，留取各組小鼠左側(cè)腎組織標(biāo)本于液氮中速凍，后保存于-80℃冰箱，以待檢測。

2.3 指標(biāo)檢測方法

2.3.1 Rt-qPCR 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達(dá) 取出腎組織標(biāo)本，用Trizol 法提取總RNA，后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：PCR 試管加入總RNA 5μL、2×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液10μL、逆轉(zhuǎn)錄引物（1μM）1.2μL、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）0.2μL，用DEPC水加至20μL，30℃30min；42℃30min；85℃10min。實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)：試管中加入2×定量PCR Master Mix 10μL、上游引物（20μM）0.08μL、下游引物（20μM）0.08μL、cDNA 模板2μL、Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL，用dd H2O 加至20μL，95℃，3min 變性；95℃，12s；62℃，40s，40 個循環(huán)。讀取CT（cycle threshold）值，計算2-△△CT值對目的mRNA 相對定量分析。查詢Genbank 數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，并采用primer express 進(jìn)行引物設(shè)計，由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司合成引物。Col-Ⅰ上游引物序列：5'-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3'，下 游：5'-CCACGTCTCACCATTGGGG-3'；Col-Ⅲ上游引物序列：5'-CCTGGCTCAAATGGCTCAC-3'，下 游：5'-CAGGACTGCCGTTATTCCCG-3'；Mus Actb 為內(nèi)參，上游引物序列：5'-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'。

2.3.2 Western blot 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá) 每個腎組織樣本加入300μL 組織細(xì)胞裂解液，用槍混勻使其完全裂解，將裂解物移至新的離心管中。直接取10μL 樣本加入10μL 2×SDS-PAGE loading buffer，混勻，100℃加熱處理5min，冰上冷卻，12000g，14000r/min，離心15min 去除不溶性沉淀。樣品使用10% SDS-PAGE 分離，每孔上樣量為20μL。電泳結(jié)束后，將PVDF 膜在甲醇中浸泡1min，再使用Transfer Buffer 浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF 膜一起4℃放置10min，然后制備轉(zhuǎn)移三明治。注：本實(shí)驗(yàn)使用Semi-Dry Cell 進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為30mA 90min。使用Blocking Buffer 封閉轉(zhuǎn)印膜4℃封閉過夜，第二天用1×TBST洗滌3 次，每次15min。加入稀釋好的一抗，37℃溫育2h。用1×TBST 洗滌4 次，每次10min。加入稀釋好的二抗，37℃溫育2h。用1×TBST 洗滌4 次，每次10min。用SuPer-GL ECL 超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并對X 光片曝光。經(jīng)顯影定影處理后，晾干的膠片最后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，本實(shí)驗(yàn)采用Gel-Pro Analyzer 軟件進(jìn)行分析處理。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間差異性比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Rt-qPCR 檢測腎組織Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達(dá) 模型組Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA 表達(dá)均較假手術(shù)組顯著增強(qiáng)（P＜0.01），證明造模成功；比較模型組，纈沙坦組、溫陽消癥組Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達(dá)均顯著下降（P＜0.01），溫陽消癥組Col-Ⅰ，Col-ⅢmRNA 表達(dá)下降程度較纈沙坦組更明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達(dá)水平比較（2-△△CT，）

表1 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA 表達(dá)水平比較（2-△△CT，）

注：假手術(shù)組和模型組給予0.2mL 生理鹽水灌胃；纈沙坦組給予纈沙坦水懸液灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量16.5mg/kg）；溫陽消癥組給予溫陽消癥方水煎劑灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量49g/kg）；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與纈沙坦組比較，cP＜0.01

3.2 Western blot 檢測腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Col-Ⅰ及Col-Ⅲ蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），證明造模成功；纈沙坦組、溫陽消癥組小鼠腎組織Col-Ⅰ，Col-Ⅲ蛋白表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.01），溫陽消癥組下降程度比纈沙坦組更明顯（P＜0.01）。見表2，圖1。

表2 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平比較（）

表2 各組小鼠腎組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平比較（）

注：假手術(shù)組和模型組給予0.2mL 生理鹽水灌胃；纈沙坦組給予纈沙坦水懸液灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量16.5mg/kg）；溫陽消癥組給予溫陽消癥方水煎劑灌胃（濃度4.9g/mL，給藥劑量49g/kg）；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與纈沙坦組比較，cP＜0.01

圖1 Western bolt 檢測小鼠腎組織Col-Ⅰ及Col-Ⅲ蛋白表達(dá)

4 討論

細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的直接原因，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ是最主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，不但能將各種ECM 成分聯(lián)結(jié)起來，還可誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞合成其他ECM 成分。生理情況下，膠原對修復(fù)各種致病因素引起的腎臟損傷有重要的作用，當(dāng)致病因素持續(xù)存在時，修復(fù)過程則會出現(xiàn)失控、紊亂，膠原纖維大量聚集，替代正常的腎組織，引起腎單位失功，進(jìn)展至終末期腎臟病。

目前尚無治療腎間質(zhì)纖維化的特效藥，臨床已證實(shí)有確切療效的藥物首選血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的藥物。AngⅡ不僅是血管收縮劑，也是重要的腎臟促纖維化因子，可通過一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β 等因子的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的堆積。本研究的陽性對照藥物纈沙坦膠囊即是AngⅡ受體拮抗劑。研究結(jié)果提示，纈沙坦組與溫陽消癥組Col-I、Col-Ⅲ蛋白與mRNA 的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01），證明兩種藥物均可減輕膠原的堆積，延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，而溫陽消癥組膠原表達(dá)的下降程度較纈沙坦組更甚（P＜0.01），提示溫陽消癥方可能在減輕腎纖維化方面療效更優(yōu)。

中醫(yī)認(rèn)為，“陽氣”是人體物質(zhì)構(gòu)成和能量發(fā)生的本源，人體的功能發(fā)揮以陽氣充沛為基礎(chǔ)，亦因陽氣虛衰而致病，因此我們認(rèn)為，陽虛是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的本因。“瘀血”是腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中不可或缺的環(huán)節(jié)，中醫(yī)理論認(rèn)為“久病入絡(luò)，久病多瘀”，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，腎臟毛細(xì)血管袢閉塞、微血栓形成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等都是瘀血的表現(xiàn)。張沛虬醫(yī)師根據(jù)腎間質(zhì)纖維化“陽虛血瘀”的病機(jī)，擬以溫陽消癥方溫補(bǔ)脾腎，消癥化瘀。方中以黃芪、黨參益氣健脾，仙靈脾、肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽；桃仁、莪術(shù)、川芎行氣活血，化瘀消癥。研究表明，本方中多種成分在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有抗腎纖維化的作用，如黃芪是目前抗腎纖維化中藥中研究最廣泛的藥物之一，黃芪甲苷可使UUO 大鼠血肌酐、尿素氮下降，下調(diào)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及纖維連接蛋白（FN）的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad 蛋白（TGF-β/smad）信號通路，延緩糖尿病模型小鼠腎纖維化進(jìn)展[10]。研究還表明，黃芪甲苷通過抑制miR-21 過度表達(dá)誘導(dǎo)的足細(xì)胞去分化和糖尿病腎病單核細(xì)胞活化來改善腎纖維化[11]。淫羊藿總黃酮可下調(diào)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠TGF-β1 蛋白表達(dá)，對腎臟損傷有改善作用[12]。

綜上，溫陽消癥方可下調(diào)Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA和蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的堆積，從而減輕UUO 小鼠腎間質(zhì)纖維化程度。不足之處在于本研究尚不能明確解釋發(fā)生作用的分子靶點(diǎn)，因此，研究溫陽消癥方發(fā)生作用的環(huán)節(jié)，調(diào)控何種因子、通路，是我們未來研究的方向。