林雅柔 岑競儀 王建艷 梁芊艷 呂頌輝

中國南海四種凱倫藻種間作用與溶血活性初步研究*

林雅柔1岑競儀1①王建艷2梁芊艷1呂頌輝1

(1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院赤潮與海洋生物學(xué)研究中心 廣州 510632; 2. 北京自然博物館 科學(xué)研究部 北京 100010)

凱倫藻屬種類廣布于世界沿海海域甚至大洋, 屬廣域分布種。該屬下多個種類曾在全球近岸海域暴發(fā)有毒有害赤潮, 造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 其中不乏由多種凱倫藻同時混合形成赤潮的現(xiàn)象存在。在2016年香港海域的一次凱倫藻赤潮中, 本團(tuán)隊從赤潮海水中分離出了米氏凱倫藻()、長溝凱倫藻()、鞍形凱倫藻()和蝶形凱倫藻() 4種凱倫藻。本研究以此4種凱倫藻進(jìn)行單種藻及多種藻混合樣品的培養(yǎng)和溶血活性研究, 以探究復(fù)合型凱倫藻的種間作用及溶血活性。結(jié)果表明, 4種凱倫藻間存在種間相互作用, 長溝凱倫藻會促進(jìn)蝶形凱倫藻的生長, 鞍形凱倫藻和米氏凱倫藻會抑制長溝凱倫藻生長。4種凱倫藻對兔血紅細(xì)胞均有明顯溶血活性, 長溝凱倫藻溶血活性最強(qiáng)為46.36%±1.02%。每種凱倫藻與其他凱倫藻混合培養(yǎng)3天后, 對兔血的溶血活性會明顯增加, 其中含4種凱倫藻的混合組溶血活性最高, 為57.05%±1.13%。

蝶形凱倫藻; 鞍形凱倫藻; 長溝凱倫藻; 米氏凱倫藻; 溶血活性; 有害赤潮

凱倫藻屬()隸屬于裸甲藻目(Gymnodiniales)凱倫藻科(Kareniaceae), 該屬多個種類在世界范圍內(nèi)頻繁暴發(fā)有毒有害赤潮, 備受各界關(guān)注(Brand, 2012; 俞志明等, 2019; Li, 2019)。凱倫藻屬的種類大多具有毒性, 目前已報道的12種中有10種曾引發(fā)有毒有害赤潮, 災(zāi)害效應(yīng)包括致使養(yǎng)殖魚類和貝類等海洋生物死亡, 引起食用者產(chǎn)生腹瀉、痙攣、麻痹昏迷或引起呼吸困難綜合癥等(Brand, 2012)。凱倫藻可產(chǎn)短裸甲藻毒素(Brevetoxin)、溶血毒素(Hemotoxin)、細(xì)胞毒素(Cytotoxin)、環(huán)亞胺毒素(Gymnodimine)和魚毒素等毒素(Baden, 1979; Baden, 1989; Haywood, 2004)。

短凱倫藻()和米氏凱倫藻(是凱倫藻屬下最早也是受關(guān)注最多的兩個種類。資料顯示, 1946—1947年在美國佛羅里達(dá)西海岸暴發(fā)持續(xù)了將近11個月的短凱倫藻赤潮, 導(dǎo)致大型鯊魚及海洋生物死亡, 是歷史上最嚴(yán)重的赤潮之一(Steidinger, 2009)。米氏凱倫藻最早于1935年報道自日本海域, 目前已在挪威、新西蘭、澳大利亞、南美、北非和中國等海域引發(fā)過赤潮, 該種是全球范圍內(nèi)凱倫藻類赤潮的主要肇事種(Oda, 1935; Seki, 1995; Sellem, 2000; Yang, 2004; Mitchell, 2007; Li, 2019)。

在我國近海, 米氏凱倫藻也是典型的有害赤潮致災(zāi)種。自20世紀(jì)90年代起, 米氏凱倫藻在我國近海海域(特別在我國東海海域)多次暴發(fā)有害赤潮(Lu, 2014; Li, 2019)。僅2006—2018年間, 在我國沿海報道的米氏凱倫藻赤潮事件超過100起, 其中在2012年尤其嚴(yán)重, 致使養(yǎng)殖鮑魚大面積死亡, 總經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20.11億元(Li, 2017; 中國海洋災(zāi)害公報, 2013)。米氏凱倫藻會對魚類和哺乳動物造成負(fù)面影響, 抑制浮游動物的生長發(fā)育、攝食和采卵, 從而降低捕食者對其的攝食壓力; 并會抑制某些敏感貝類幼體早期發(fā)育, 嚴(yán)重時可致其幼體和成體死亡(王朝暉等, 2001; 孫軍等, 2007; Mitchell, 2007; 孫科等, 2010; Basti, 2015; Lin, 2015; Li, 2017)。

近年來, 隨著研究的深入, 越來越多的凱倫藻種類被分離并鑒定, 多個種類共同形成赤潮的現(xiàn)象也時有發(fā)生。如, 在2007—2008年佛羅里達(dá)西海岸的短凱倫藻赤潮事件中, 共分離鑒定出4種凱倫藻等, 包括米氏凱倫藻、鞍形凱倫藻()、蝶形凱倫藻()和1種未知凱倫藻(sp.)(Wolny, 2015)。2003年5月在澳大利亞沿岸也曾暴發(fā)了一起由5種凱倫藻(、及其他3種spp.)混合組成的赤潮(de Salas, 2004)。在我國近海, 復(fù)合型凱倫藻赤潮也有發(fā)生, 如1998年暴發(fā)于香港海域的凱倫藻赤潮, 其優(yōu)勢種為米氏凱倫藻和指溝凱倫藻(, 現(xiàn)已修訂為指溝卡羅藻)(Lu, 2004)。

溶血毒素是一種結(jié)構(gòu)和成分較為復(fù)雜的多成分混合物, 目前已知的組成成分有糖脂類(glycolipids)、糖苷類和多不飽和脂肪酸類化合物、肽類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)等(劉桂英等, 2015)。1994年Arzul等(1994)首次報道米氏凱倫藻法國株系對鱒魚紅細(xì)胞具有溶血活性, 隨后研究者發(fā)現(xiàn)不同地理株系(英格蘭、美國、日本和中國)的米氏凱倫藻對魚類及陸生哺乳動物紅細(xì)胞也具有溶血活性(Cho, 2017)。已報道具有溶血活性的凱倫藻種類有米氏凱倫藻、協(xié)和凱倫藻()和短凱倫藻, 而其他凱倫藻是否具有溶血活性目前尚未見報道(Neely, 2016; Tatters, 2010; Brand, 2012)。

2016年1月1日至2月8日, 在中國香港吐露港海域暴發(fā)凱倫藻赤潮, 其主要肇事種為米氏凱倫藻和少量蝶形凱倫藻, 此次赤潮導(dǎo)致大量養(yǎng)殖魚死亡(漁農(nóng)自然護(hù)理署, 2016)。本文作者從此次赤潮香港吐露港海域以及鄰近香港的大鵬灣海域采集的樣品中分離出4種凱倫藻(蝶形凱倫藻、鞍形凱倫藻、長溝凱倫藻和米氏凱倫藻)。本文對此4種凱倫藻的混合生長特性和溶血活性進(jìn)行研究, 比較分析不同凱倫藻混合培養(yǎng)對溶血活性的影響, 旨在探究單一凱倫藻和復(fù)合型凱倫藻赤潮溶血活性的差異, 為我國有害赤潮的防治與研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

本實驗所用4種凱倫藻分別為蝶形凱倫藻CCHA-12 (Genbank: MT754557)、鞍形凱倫藻CCHA-7 (Genbank: MT754561)、長溝凱倫藻CCHA-9 (Genbank: MT754556)和米氏凱倫藻CCHA-1 (Genbank: MT754546)。蝶形凱倫藻和鞍形凱倫藻為2016年1月底香港赤潮時分離, 米氏凱倫藻和長溝凱倫藻于2016年4月底分離自香港鄰近的大鵬灣海域。單細(xì)胞克隆培養(yǎng)后, 在電鏡及光鏡下對其形態(tài)觀察。藻種保存于暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻類種質(zhì)資源庫。所有實驗在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行, 培養(yǎng)條件為: 培養(yǎng)液為L1培養(yǎng)基, 光照強(qiáng)度為3500—3800lx, 光暗比為12h︰12h, 溫度為(20±1)°C。同時, 以東海原甲藻()為陰性對照藻種(已知東海原甲藻的超聲破碎細(xì)胞提取液無溶血活性)(周成旭等, 2007)。每個實驗組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 掃描電鏡及光學(xué)顯微鏡方法

掃描電鏡: 用濃度為2. 5%戊二醛固定, 4°C冰箱靜置12h。然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100% ( 2 次)的乙醇進(jìn)行梯度脫水, 再經(jīng)二氧化碳臨界點干燥和噴金導(dǎo)電, 最后在掃描電鏡觀察(wang, 2018)。

光學(xué)顯微鏡: 通過奧林巴斯正置顯微對指數(shù)期的藻細(xì)胞進(jìn)行觀察, 并采集照片, 使用image - pro Plus 6.0圖像采集和分析軟件(QImaging, Surrey, BC, Canada)測量細(xì)胞長度和寬度 (wang, 2018) 。

1.3 比生長速率計算方法

比生長速率(單位: /d)計算公式如下:

=(ln-ln)/Δ, (1)

式中,為培養(yǎng)天的藻細(xì)胞密度;為起始的藻細(xì)胞密度; Δ表示培養(yǎng)時間間隔。

1.4 凱倫藻溶血毒素的提取

取指數(shù)生長期的凱倫藻藻液, 于倒置顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板統(tǒng)計密度后(表1), 用以檢測單種凱倫藻溶血活性。另外, 將此密度下的4種凱倫藻按照表2列出的不同混合方式等體積混合, 共培養(yǎng)3天后, 在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)四種凱倫藻不同形態(tài)區(qū)分并統(tǒng)計各自密度, 離心收集藻細(xì)胞。

顯微鏡計數(shù)方法: 1mL藻液加入魯格氏試劑染色, 然后用漩渦混勻器將其充分混勻, 準(zhǔn)確吸取藻液細(xì)胞0.1mL, 置于容量為0.1mL、表面積為20mm×20mm的計數(shù)框內(nèi), 在200倍顯微鏡下全部計數(shù), 計數(shù)3次取其平均值 (張士璀等, 1997; 周永欣等, 1989) 。

溶血毒素提取方法參照Eschbach等(2001), 將收集的藻細(xì)胞重懸于400μL緩沖液中, 于超聲破碎儀中冰浴破碎(破碎功率10%, 時長5min, 每次脈沖2s, 脈沖間隔1s), 獲得細(xì)胞破碎液用于溶血毒素提取液。

表1 四株凱倫藻取樣密度

Tab.1 Sample density of the four Karenia species

表2 各組凱倫藻混合前后初始密度

Tab.2 The initial density of each group before and after being mixed

注: A—F: 兩種藻混合; G—J: 三種藻混合; K: 四種藻混合

1.5 凱倫藻溶血活性檢測

稱取8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na2HPO4·12 H2O和0.215g KH2PO4, 溶解至1L高純水中, 用0.1mol/L HCL鹽酸調(diào)pH 7.4, 制備成兔血紅細(xì)胞緩沖液, 儲存于4°C冰箱備用。

稱取8.775g NaCl、0.238g KCl、0.15g MgSO4、0.551g CaCl2·2H2O和1.476g TRIS溶解至1L高純水中, 用0.1mol/L HCL鹽酸調(diào)pH 7.4, 制備成溶血毒素緩沖液, 置于4°C冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

取購買自蕊特生物公司的EDTA抗凝兔血100mL, 800r/min離心洗滌兩次, 每次10min。以兔血緩沖液為溶劑, 配制成0.6%的兔血紅細(xì)胞溶液。

溶血活性測定參照周成旭等(2007)方法并略有改進(jìn)。取150μL溶血毒素提取液和150μL 0.6%的兔血紅細(xì)胞于1.5mL離心管中混勻, 置于20°C, 光照強(qiáng)度為100μmol(m2·s)的條件下反應(yīng)5h; 再于20°C下, 3000r/min, 離心10min, 取上清液于酶標(biāo)儀414nm處檢測其吸光值。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行樣。

溶血活性計算公式為:

溶血活性百分?jǐn)?shù)(%)=(As-Ab-Aa)/Ac×100%, (2)

式中, As: 150μL的溶血毒素提取液與150μL 0.6%的兔血紅細(xì)胞置于上述條件下反應(yīng)后的離心上清液的吸光值; Aa: 150μL的溶血毒素的緩沖液與150μL 0.6%的兔血紅細(xì)胞置于上述條件下相同時間后離心上清液的吸光值; Ab: 150μL的溶血毒素提取液與150μL兔血紅細(xì)胞緩沖液置于上述條件下相同時間后離心上清液的吸光值; Ac: 150μL TritonX·100與150μL 0.6%兔血紅細(xì)胞置于上述條件下相同時間后離心上清液的吸光值。

每細(xì)胞溶血活性計算公式: 每細(xì)胞溶血活性百分?jǐn)?shù)(%)=溶血活性百分?jǐn)?shù)?總細(xì)胞數(shù). (3)

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用origin 2018軟件繪圖, 數(shù)據(jù)使用SPSS軟件ANOVA、LSD功能進(jìn)行方差分析, 對各實驗與對照組均值之間的差異性進(jìn)行顯著性檢驗。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 種凱倫藻形態(tài)學(xué)特征

長溝凱倫藻, 單細(xì)胞, 細(xì)胞長21.7—31.7μm, 寬15.6—26.3μm。細(xì)胞呈近圓球形或卵圓形, 背腹扁平程度低, 上下殼部均呈現(xiàn)半球形。頂溝長, 腹面達(dá)到橫溝上邊緣之下。上殼部具有放射狀的犁溝, 縱溝在上殼部具有指狀入侵(圖1a, 1e)。

米氏凱倫藻, 單細(xì)胞, 細(xì)胞長15.6—31.2μm, 寬13.2—24μm。細(xì)胞背腹面呈近寬卵圓形, 背腹略顯扁平, 上錐部為半球形或略寬的圓錐形?？v溝入侵上殼部呈指狀。頂溝平直, 其頂端有一個缺口(圖1b, 1f)。

蝶形凱倫藻, 單細(xì)胞, 長18—32μm, 寬18—48μm, 長寬比約為1︰1, 部分細(xì)胞寬大于長。細(xì)胞背腹扁平, 上頂端突出形成龍骨突狀, 下殼部腹面凹進(jìn), 背面凸起, 兩裂片狀(圖1c, 1g)。

鞍形凱倫藻, 單細(xì)胞, 細(xì)胞平均長20—30μm, 寬16—30μm。上殼部扁平, 半圓形或圓錐形, 頂端不突出, 無龍骨突。下殼部底部不平截, 中央凹陷深, 底端兩裂片呈馬鞍形(圖1d, 1h)。

圖1 四種凱倫藻形態(tài)照片

注: a、e: 長溝凱倫藻; b、f: 米氏凱倫藻; c、g: 蝶形凱倫藻; d、h: 鞍形凱倫藻。

a—d為四種凱倫藻電鏡照片, 比例尺=2μm; e—h為四種凱倫藻掃描光鏡照片, 比例尺=10μm。

2.2 凱倫藻比生長速率及種間作用

取培養(yǎng)3天的不同凱倫藻混合組藻液, 于顯微鏡下鏡檢細(xì)胞密度, 結(jié)果如表2所示。培養(yǎng)3天后各組藻密度均維持在106cells/L左右, 但未達(dá)到107cells/L。分析發(fā)現(xiàn), 當(dāng)兩種不同的凱倫藻進(jìn)行混合培養(yǎng)時存在種間相互作用: 長溝凱倫藻會抑制米氏凱倫藻和鞍形凱倫藻生長, 促進(jìn)蝶形凱倫藻的生長(圖2a); 蝶形凱倫藻會抑制米氏凱倫藻和鞍形凱倫藻生長(圖2b); 鞍形凱倫藻會抑制長溝凱倫藻生長, 對米氏凱倫藻和蝶形凱倫藻生長無明顯影響(圖2c); 米氏凱倫藻抑制長溝凱倫藻生長, 微弱地抑制鞍形凱倫藻生長, 而對蝶形凱倫藻生長無明顯的影響(圖2d)。

對各實驗組的比生長速率進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 4種凱倫藻按照不同組合混合3天的平均比生長速率差異較大, 混合組內(nèi)凱倫藻間存在種間相互影響。比生長速率最高組為E混合組(0.48/d), 其次為G組和K組, 分別為0.26和0.29/d。各凱倫藻比生長速率范圍為: 米氏凱倫藻-0.21—0.22/d、蝶形凱倫藻-0.05— 0.58/d、長溝凱倫藻-0.27—0.31/d、鞍形凱倫藻-0.20— 0.30/d。其中E組內(nèi)的蝶形凱倫藻生長速率為0.58/d, 高于其單種指數(shù)生長期平均生長速率(0.48/d), 說明蝶形凱倫藻與長溝凱倫藻混合后提高其比生長速率。混合組H的比生長速率為-0.03/d, 混合組內(nèi)的米氏凱倫藻(-0.21/d), 鞍形凱倫藻(-0.20/d)和蝶形凱倫藻(-0.05/d), 比生長速率為負(fù)值, 說明混合3天后三種藻的細(xì)胞密度都比初始值低, 3種凱倫藻間存在相互抑制作用(表3)。

圖2 四種凱倫藻對其他藻化感作用

表3 4種凱倫藻不同組合的比生長速率

Tab.3 The growth rates of different combinations of four Karenia species

2.3 凱倫藻的溶血活性

4種凱倫藻單獨培養(yǎng)時與對照組(海水組、東海原甲藻組)相比, 表現(xiàn)出明顯的溶血活性。4種凱倫藻的溶血活性百分?jǐn)?shù)從高到低依次為長溝凱倫藻(46.36%±1.02%), 鞍形凱倫藻(42.33%±0.66%), 米氏凱倫藻(37.81%±0.82%)和蝶形凱倫藻(37.02%± 0.64%)(圖3)。本研究的米氏凱倫藻大鵬灣株的溶血活性(0.33×104cells/mL)與中國福建株系(1.2×104cells/mL)和日本(Suo Nada)株系對兔血的溶血活性相近, 為37.81%±0.82% (表4)。

與對照組相比, 兩種凱倫藻共培養(yǎng)實驗組(A—F組)均表現(xiàn)出溶血活性。溶血活性最高的前三組依次為D組(長溝凱倫藻與米氏凱倫藻共培養(yǎng))、C組(長溝凱倫藻與鞍形凱倫藻共培養(yǎng))和B組(長溝凱倫藻與蝶形凱倫藻共培養(yǎng)), 溶血活性依次為56.54%±1.49%、56.44%±1.09%和53.70%±1.13%。三種凱倫藻共培養(yǎng)實驗組(G—J組)的溶血活性百分?jǐn)?shù)與對照組相比均有顯著差異, 其中G組(長溝凱倫藻、鞍形凱倫藻、米氏凱倫藻)和I組(長溝凱倫藻、鞍形凱倫藻、蝶形凱倫藻)溶血活性超過50% (分別為52.49%±0.62%和50.57%±0.73%)。四種凱倫藻混合組(K組)測得的溶血活性溶血百分?jǐn)?shù)為57.05%±1.13% (圖4)。

圖3 四株凱倫藻的溶血活性及每細(xì)胞溶血活性

注: a、b、c、d表示組之間具有顯著差異,≤0.05

表4 不同地理株系凱倫藻溶血活性

Tab.4 The hemolytic activity of strains from different Karenia species

圖4 混合組凱倫藻溶血活性

注: CK為東海原甲藻組, 不同小寫字母(a—f)表示組間具有顯著差異,≤0.05

每細(xì)胞溶血活性計算結(jié)果表明, 4種凱倫藻單一培養(yǎng)時每細(xì)胞活性從高到低為長溝凱倫藻>蝶形凱倫藻>鞍形凱倫藻>米氏凱倫藻, 每細(xì)胞溶血活性分別為2.58、1.51、1.30和0.86×10–3%/cell?；旌虾竺考?xì)胞溶血活性百分?jǐn)?shù)為(0.59—1.77)×10–3%/cell, 與單種相比表現(xiàn)出下降的趨勢。混合組D組(長溝凱倫藻和米氏凱倫藻)每細(xì)胞溶血活性最高, 為1.77× 10–3%/cell, E組(長溝凱倫藻和蝶形凱倫藻)每細(xì)胞溶血活性最低, 為0.59×10–3%/cell。4種凱倫藻間相互混合能夠增加對兔血的溶血活性, 但不會提高單位細(xì)胞溶血活性(圖5)。

圖5 不同混合方式凱倫藻每細(xì)胞溶血活性

3 討論

赤潮是海洋中某種或某幾種生物在短時間內(nèi)大量聚集或者異常增殖而引起海水變色的現(xiàn)象, 其歸根結(jié)底是赤潮優(yōu)勢種在各種理化條件下獲得競爭優(yōu)勢, 從而占據(jù)生態(tài)位的過程。赤潮生物種群演替也是赤潮生物之間的種間競爭的結(jié)果。海洋微藻通過產(chǎn)生胞外活性物質(zhì)參與種間競爭(化感作用), 進(jìn)而間接實現(xiàn)藻類與其他生物類群之間、藻類不同種群間的相互作用, 從而影響藻類群落的組成、演替和平衡。藻類的化感作用可能是促使其形成赤潮的動力學(xué)的機(jī)制之一(Smayda, 1997; Legrand,2003)。研究報道, 大約有40種有毒有害浮游藻類(海洋和淡水種類)對其它藻類存在化感作用(Granéli,2008; Poulin, 2018)。本研究中分離自中國南海的4種凱倫藻相互間都具有化感作用, 并存在種間差異。其中鞍形凱倫藻和米氏凱倫藻分別與長溝凱倫藻混合時, 都會抑制長溝凱倫藻的生長(比生長速率分別為-0.14和-0.08/d); 蝶形凱倫藻與長溝凱倫藻混合時, 蝶形凱倫藻的比生長速率高于單種藻平均生長速率, 可見長溝凱倫藻促進(jìn)其生長。3種凱倫藻混合組內(nèi)種間也有相互抑制生長的化感作用, 其中鞍形凱倫藻、蝶形凱倫藻和長溝凱倫藻混合組的抑制作用最明顯, 比生長速率都為負(fù)值。

實驗室研究發(fā)現(xiàn), 同一種藻可對不同藻類產(chǎn)生化感作用。如, 米氏凱倫藻與東海原甲藻, 塔瑪亞歷山大藻(), 中肋骨條藻(), 球等鞭金藻(), 杜氏藻()等藻類共培養(yǎng)時會抑制其生長(Gentien, 1990; Uchida, 1999; Yang, 2011; He, 2016)。同一種藻對其他不同藻類的化感作用具有種間差異。如, 新月筒柱藻()會抑制東海原甲藻生長, 但對心形原甲藻(), 球等鞭金藻和旋鏈角毛藻()化感作用不明顯(Xu, 2019)。短凱倫藻會抑制假微海鏈藻()生長, 但對冰河擬星桿藻()的化感作用不明顯(Poulson-Ellestad, 2014)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 即便同一株系對同一種藻的化感作用也是可變的。Poulin 等(2018)對短凱倫藻5個不同的株系(CCMP 2228, CCMP 2229, CCMP 2281, TxB3, TxB4)開展化感作用研究, 5個株系的短凱倫藻對冰河擬星桿藻的化感作用是高度可變, 同一株系可以強(qiáng)烈抑制冰河擬星桿藻生長或無化感作用或極其微弱的促進(jìn)作用, 研究還表明這種化感作用的可變性與短凱倫藻的幾種代謝物濃度相關(guān)。

溶血毒素被認(rèn)為是凱倫藻赤潮引起海洋魚類及其他海洋生物的大量死亡的主要原因之一(Li, 2017, 2019)。海洋藻類溶血毒素是其次生代謝的產(chǎn)物, 該類物質(zhì)種類繁多, 結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜。已明確具有溶血活性的凱倫藻類有米氏凱倫藻、短凱倫藻和鞍形凱倫藻(Tatters, 2010; Brand, 2012)。其中米氏凱倫藻溶血毒素包括兩種糖脂類物質(zhì)(monogalactosyl diacylglycerol和digalactosyl diacylglycerol)和一種脂類物質(zhì)(octadecapentaenoic acid)(Parrish, 1998)。本研究結(jié)果表明, 分離于中國南海海域的4種凱倫藻對兔血細(xì)胞都具有溶血活性, 其中蝶形凱倫藻和長溝凱倫藻的溶血活性為首次報道。海洋微藻引起的溶血活性及魚毒性與多聚不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFA)相關(guān), 研究發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻中分離的PUFA具有溶血活性, 而蝶形凱倫藻和傘輻凱倫藻()(現(xiàn)修訂為長溝凱倫藻)也能產(chǎn)生PUFA, 這可能是它們具有溶血活性的原因(Yasumoto, 1990; Fu, 2004; Hyun, 2016; Wang, 2018)。在本研究中, 長溝凱倫藻的溶血活性在四種凱倫藻中溶血活性最高, 且在每種混合培養(yǎng)方式中(兩種、三種、四種混合培養(yǎng)), 溶血活性最高的混合組皆為含有長溝凱倫藻的組。但目前尚未有長溝凱倫藻可產(chǎn)毒素的報道, 也沒有表明對人類有傷害, 僅對魚有致死現(xiàn)象(Brand, 2012)。

不同株系的米氏凱倫藻的溶血活性存在差異, 同一株系對不同生物紅細(xì)胞的溶血活性也存在差異(Zou, 2010)。本研究的深圳大鵬灣株的米氏凱倫藻溶血活性為37.81%與中國福建海域株系(1.2×104cell/L)對兔血的溶血活性(38.67%)相近(Li, 2017)。米氏凱倫藻英國株系和美國德州株系對紅魚()血細(xì)胞的溶血活性約為50%對分離于日本不同海灣的6株米氏凱倫藻溶血活性研究發(fā)現(xiàn), 其中3株對兔血無溶血活性, 而另外3株對兔血的溶血活性差異較大分別為10%—20%、39%及70% (Zou, 2010; Cho, 2017; Kima, 2020)。Yang等(2011)研究發(fā)現(xiàn), 米氏凱倫藻與東海原甲藻、塔瑪亞歷山大藻混合培養(yǎng)后, 會增加米氏凱倫藻溶血活性。同樣, 本研究結(jié)果表明, 4種凱倫藻相互混合培養(yǎng)后其溶血活性相對于單種凱倫藻會有顯著增加, 其中4種凱倫藻共培養(yǎng)的溶血活性溶血最高。

據(jù)統(tǒng)計, 1934—2018年全球有明確記錄的米氏凱倫藻赤潮事件有87起, 其中導(dǎo)致魚類死亡的34件, 導(dǎo)致貝類死亡的有13件, 導(dǎo)致其他生物死亡的有10件, 無報道生物死亡的有49件(Li, 2019)。凱倫藻個體小, 不同種藻細(xì)胞形態(tài)差異小, 在光學(xué)顯微鏡下很難區(qū)別。因此, 在野外條件下常常無法準(zhǔn)確判定赤潮肇事種為某一凱倫藻還是多種凱倫藻混合, 故也難以判定赤潮災(zāi)害是由單一藻種還是混合藻種所致。2007年9月至2008年1月, 美國佛羅里達(dá)州東海岸暴發(fā)了一次以短凱倫藻為主并混合其他4種凱倫藻的赤潮, 研究人員從海域養(yǎng)殖貝殼中檢測出神經(jīng)性貝類毒素(neurotoxic shellfish poisoning), 并且赤潮過程中導(dǎo)致魚類死亡及人類呼吸系統(tǒng)疾病等(Wolny, 2015)。2019年5月我國福建海域暴發(fā)以東海原甲藻和“米氏凱倫藻”為主要肇事種的赤潮, 該赤潮導(dǎo)致2700萬人民幣損失(中國海洋災(zāi)害公報, 2020), 而對赤潮優(yōu)勢種進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 此次赤潮的肇事種以指溝卡羅藻和東海原甲藻為主, 同時混有蝶形凱倫藻及其他凱倫藻科種類(Cen, 2020)。結(jié)合本研究結(jié)果——米氏凱倫藻、鞍形凱倫藻、蝶形凱倫藻和長溝凱倫藻4種凱倫藻, 不論是兩種、還是三種、四種共同培養(yǎng)時, 溶血活性都顯著高于單一藻種, 可見, 混合型凱倫藻赤潮的致災(zāi)效應(yīng)更為嚴(yán)重, 其成災(zāi)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

對分離于中國南海的4種凱倫藻(蝶形凱倫藻、鞍形凱倫藻、長溝凱倫藻和米氏凱倫藻)進(jìn)行種間作用和溶血活性研究表明, 該4種凱倫藻均對兔血均具有溶血活性; 該4種凱倫藻不論是兩種、還是三種、四種共同培養(yǎng)時, 溶血活性都顯著高于單一藻種?；旌吓囵B(yǎng)時, 凱倫藻存在種間相互作用, 長溝凱倫藻會促進(jìn)蝶形凱倫藻的生長, 鞍形凱倫藻和米氏凱倫藻會抑制長溝凱倫藻生長。

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PRELIMINARY STUDY ON INTERSPECIFIC RELATIONSHIP AND HEMOLYTIC ACTIVITY OF FOURSPECIES FROM SOUTH CHINA SEA

LIN Ya-Rou1, CEN Jing-Yi1, WANG Jian-Yan2, LIANG Qian-Yan1, LYU Song-Hui1

(1. College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Department of Science Research, Beijing Museum of Natural History, Beijing 100010, China)

species are widely distributed in the coastal waters around the world, and are notorious for forming harmful algae blooms. In generally, thealgae bloom isn’t caused by mono-species but the simultaneous mixing of multi-species in the same family. In China coastal waters, we observed a multi-species bloom involving fourspecies (.,.,., and.) in 2016, in Hong Kong coastal area. Therefore, we conducted co-culture experiment on the fourspecies in different combinations (two species, three species or four species) in laboratory, to investigate their interspecific-relationship and hemolytic activities. The results show that the fourspecies significantly affected each other in the co-culture.promoted the growth of, andandinhibited the growth of. The fourspecies had significant hemolytic effects on rabbit red blood cells, and the most significant hemolytic activity was produced bywith a value of 46.36%±1.02%. After co-culture for three days, the hemolytic effects of all combination groups increased, and co-culture of the four species yielded the highest hemolytic effects with a value of 57.05%±1.13%.

;;;; hemolytic activity; harmful algal blooms

* 國家重點研發(fā)計劃, 2017YFC1404301號, 科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項, 2018FY100200號; 國家自然科學(xué)基金項目 41876173號, 41906112號。林雅柔, 碩士研究生, E-mail: linyarou@126.com

岑競儀, 實驗師, 碩士, E-mail:jingyicen@gmail.com

2020-01-03,

2020-07-25

X55

10.11693/hyhz20200100002