王菊 李龍 曾家順

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以持續(xù)性滑膜炎和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫疾病，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和肢體殘疾[1]。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中主要的一種細(xì)胞類型，在RA慢性炎癥環(huán)境中被激活時(shí)，具有腫瘤樣細(xì)胞的某些特征，致使RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞不斷進(jìn)展，在RA發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用[2-4]。桔梗皂苷D(platycodin D，PD)是常用傳統(tǒng)中藥桔梗的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)和藥理學(xué)作用[5]。PD能有效抑制人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞株MH7A細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但PD對(duì)MH7A細(xì)胞遷移和侵襲的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞株MH7A細(xì)胞，建立RA體外細(xì)胞模型[6-7]，觀察PD對(duì)MH7A細(xì)胞遷移和侵襲的影響，初步探討PD治療RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞株MH7A，購自北納生物科技有限公司。PD(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，雙抗(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(貴州泰思騰生物科技有限公司)；Transwell小室(8 μm孔徑)和基質(zhì)膠(美國Thermo公司)；ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；WB抗體P-PI3K、PI3K、P-PAKT、AKT，β-Actin，WB二抗(Genetex，貴州泰思騰生物科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1PD的制備 取20 mg PD，加適量的DMSO溶解，用直徑為0.22 μm的無菌濾器進(jìn)行過濾，放入無菌小瓶中，密封后避光置于4℃冰箱保存。用時(shí)取出，加適量DMEM培養(yǎng)基，配成所需濃度，最終濃度的DMSO含量為0.05%。

1.2.2體外細(xì)胞培養(yǎng) 將MH7A細(xì)胞接種于含15%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合到70%～80%時(shí)，用PBS洗3次，用含0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，按1∶2 傳代，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Wound-healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的影響 取正常培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH7A細(xì)胞，消化、離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，制成3×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板，每板接種4個(gè)孔，放入培養(yǎng)箱中靜置過夜。待MH7A細(xì)胞生長(zhǎng)融合到80%～90%，棄原培養(yǎng)基，用200 μL槍頭劃傷細(xì)胞，用1×PBS洗2遍后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，拍照記錄為0 h時(shí)的細(xì)胞劃痕狀態(tài)。隨后加入含PD藥物(濃度分組為5、10、15 mg/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(無PD，含0.05%DMSO的無血清DMEM培養(yǎng)基)，藥物作用12 h，在顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)，并評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力，放大倍數(shù)為100×，拍照記錄為12 h時(shí)的細(xì)胞劃痕狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲的影響 實(shí)驗(yàn)前，在冰浴下，取10 mg/mL的基質(zhì)膠與等體積的無血清培養(yǎng)基輕輕混勻，加入到Transwell小室的上層，37 ℃孵育4～6 h。待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞鋪板同劃痕實(shí)驗(yàn)。待MH7A細(xì)胞生長(zhǎng)融合到80%～90%，棄原培養(yǎng)基，加入含PD的DMEM培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)分組同劃痕實(shí)驗(yàn))，藥物作用24 h。取各組細(xì)胞，消化、離心并重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞/well種于Transwell小室的上室，下室加入10%血清的培養(yǎng)基500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，固定，染色，計(jì)數(shù)；顯微鏡下拍照，放大倍數(shù)為200×，并評(píng)價(jià)細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.5Western blotting檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá) 取正常培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MH7A細(xì)胞，將原培養(yǎng)基更換為含PD藥物(濃度分組為5、10、15 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(無PD，含0.05%DMSO的DMEM培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細(xì)胞，將各組細(xì)胞樣收集到1.5 EP管中，每管加入細(xì)胞裂解液200 μL，提取各組細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道約30 μg。15%的SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫水平搖床上封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，分別加相應(yīng)一抗p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K，稀釋比為1：1 000，β-Actin稀釋比為1∶5 000，4 ℃ 孵育過夜，洗膜后加入二抗，稀釋比為1∶5 000，室溫水平搖床上孵育1 h。洗膜后加入ECL發(fā)光劑，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以內(nèi)參β-actin作對(duì)照，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性和正態(tài)性檢驗(yàn)，組間差異兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PD對(duì)MH7A細(xì)胞遷移的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果回示，PD為0 mg/L，細(xì)胞遷移率(63.49±7.76)%；PD為5 mg/L，細(xì)胞遷移率(40.70±3.59)%；PD為10 mg/L，細(xì)胞遷移率(16.45±1.68)%；PD為15 mg/L，細(xì)胞遷移率(3.66±2.97)%。與空白對(duì)照組比較，隨著PD濃度的不斷增加，MH7A細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力減弱，跨越劃痕的細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞遷移百分比顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。說明PD能減弱MH7A細(xì)胞的遷移能力。

2.2PD對(duì)MH7A細(xì)胞侵襲的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果回示，PD為0 mg/L，細(xì)胞數(shù)目(26.87±0.61)個(gè)；PD為5 mg/L，細(xì)胞數(shù)目(20.93±0.83)個(gè)；PD為10 mg/L，細(xì)胞數(shù)目(15.33±0.58)個(gè)；PD為15 mg/L，細(xì)胞數(shù)目(9.67±0.23)個(gè)。與空白對(duì)照組比較，隨著PD藥物濃度的增加，MH7A細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，穿過小室的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。說明PD能減弱MH7A細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 PD對(duì)MH7A細(xì)胞遷移的影響(100×)

圖2 PD對(duì)MH7A細(xì)胞侵襲的影響(200×)

2.3PD對(duì)MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響 見圖3，與空白對(duì)照組比較，PD各濃度組細(xì)胞內(nèi)p-PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PD各濃度組細(xì)胞內(nèi)p-AKT蛋白表達(dá)水平降低，其中15 mg/L濃度組下降顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。說明PD能抑制MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖3 PD對(duì)MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

表1 PD對(duì)MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

RA的基本病理改變主要為滑膜組織增生、血管翳形成，早期炎癥環(huán)境刺激滑膜組織遷移，侵入關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)，破壞軟骨和軟骨下骨，最終導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)破壞和功能喪失[8]。目前臨床上的治療藥物僅能使RA病情緩解，仍無法治愈疾病，RA已逐漸成為造成人類喪失勞動(dòng)力和殘疾的主要原因之一[9]。近年來，研究[3-4,10]表明，RA滑膜襯里層的FLS在炎癥環(huán)境中被激活，并向腫瘤樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出增生活躍、凋亡缺失、遷移和侵襲能力增強(qiáng)的特征，是RA發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。研究[11-12]表明PD能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和侵襲的攻擊行為。本研究結(jié)果表明，PD能明顯減弱MH7A細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力，說明PD能有效抑制MH7A細(xì)胞遷移和侵襲的腫瘤樣細(xì)胞行為。為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了PD對(duì)MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。

PI3K/AKT信號(hào)通路是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲等，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中處于活躍狀態(tài)[13]。在RA的發(fā)病機(jī)制中，PI3K/AKT信號(hào)通路被異常激活，導(dǎo)致FLS出現(xiàn)過度增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)行為,與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制該信號(hào)通路已成為一種有用的治療RA的方法[14]。據(jù)PD抗腫瘤作用的相關(guān)研究表明，PD能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用[7]。C.Jaemoo[15]等的研究證明PD可以通過阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路有效抑制乳腺癌中高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231細(xì)胞活力、遷移和侵襲的行為。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平隨著PD濃度的升高而降低，說明PD能抑制MH7A細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路。

綜上，通過本實(shí)驗(yàn)，初步證明PD能抑制MH7A遷移和侵襲的行為，推測(cè)其可能的作用機(jī)制是通過抑制細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用，為PD用于治療RA提供了理論依據(jù)。而PD是否通過直接作用于PI3K/AKT信號(hào)通路或其他通路影響細(xì)胞遷移和侵襲的行為，我們將在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探索。

(本文圖1，圖2見封三)