張鵬

太原市標(biāo)準(zhǔn)計量質(zhì)檢院 山西太原 030000

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是一種常見的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界、空氣、土壤、人體皮膚表面、動物的毛皮面及呼吸道和腸道等均有發(fā)現(xiàn)繁殖體[1]。這種細菌對抵抗力弱的人有潛在的健康風(fēng)險，容易導(dǎo)致腦膜炎、急性腸道炎癥、敗血癥和皮膚炎癥。2014 年出臺的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》（GB19298-2014）取消了“菌落總數(shù)”，增加了“銅綠假單胞菌”，一度引起飲用水行業(yè)的欣喜與慌亂。雖然取消“菌落總數(shù)”指標(biāo)有助于提高包裝飲用水產(chǎn)品的合格率，但是生產(chǎn)純凈水或山泉水的企業(yè)對銅綠假單胞菌較為生疏、認(rèn)知度低、重視不足，故以為取消了菌落總數(shù)就萬事大吉。

1 設(shè)備材料與方法

1.1 待檢樣品

是由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織和負(fù)責(zé)實施的礦泉水中銅綠假單胞菌的能力驗證計劃（ACAS-PT736（2019））。收到兩組樣品編號分別為ACAS-PT73619-P973、ACASPT73619-Q695。

1.2 檢測方法

（1）實驗方法。采用《GB8538-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法》。

（2）培養(yǎng)基及試劑。假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂、綠膿菌素測定培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染液、乙酰胺肉湯，均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

（3）實驗儀器設(shè)備。三洋高壓蒸汽滅菌鍋、環(huán)凱手提式無油活塞真空泵、上海森信實驗儀器有限公司生化培養(yǎng)箱、ZF-7（B）型手提式紫外檢測燈、Microfil 漏斗、環(huán)凱無菌濾膜、VITEK2 生化鑒定儀。

（4）樣品處理。收到的樣品是西林瓶中的凍干粉，用520ml無菌水復(fù)水，打開樣品后，立即加入10ml 無菌水復(fù)水。溶解后，將其吸出放入無菌袋中。用剩余的無菌水反復(fù)清洗青霉素瓶內(nèi)壁，回收的清洗液放入上述無菌袋中。此溶液為待測樣品的原液，以保證操作過程中各環(huán)節(jié)的無菌和充分混合。

（5）實驗步驟。

①樣品稀釋。取上述水化好的520mL 樣品原液做四個稀釋度100、10-1、10-2、10-3。用無菌移液管吸取樣品溶液50ml，置于裝有450ml 無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，混勻，制備1:10 的樣品勻漿液。按上述操作步驟，制備10 倍系列稀釋樣品均化。對于每次增量稀釋，使用新的無菌吸管。

②培養(yǎng)。將平板倒置于36℃±1℃培養(yǎng)24-48h，并防止干燥。

2 結(jié)果與分析

ACAS-PT73619-P973 在CN 平板上生長兩種菌落形態(tài)：綠色菌落、白色菌落。

ACAS-PT73619-Q695 在CN 平板上生長一種菌落形態(tài)：綠色菌落。ACAS-PT73619-P973 平板上的菌落在10-3 梯度上，生長有兩種顏色的菌落，分別為綠色菌落和白色菌落。在黑暗處用波長為365nm 的紫外燈照平板，發(fā)現(xiàn)綠色菌落、白色菌落均產(chǎn)熒光。綠色菌落轉(zhuǎn)接綠膿菌素抽提培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24±2h 后進行綠膿菌素實驗，結(jié)果為陽性，則判定該綠色菌落是銅綠假單胞菌。白色菌落轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂平板上36℃±1℃培養(yǎng)24±2h，再轉(zhuǎn)接入乙酰胺肉湯中36℃±1℃培養(yǎng)24±2h 后滴入1-2 滴鈉氏試劑，未出現(xiàn)磚紅色沉淀，判定結(jié)果為陰性。同時還將兩種菌落分別用了VITEK2 鑒定儀鑒定，經(jīng)鑒定得出綠色菌落為98%Probability Pseudomonasaeruginosa 銅綠假單胞菌，白色菌落為91%Probability Pseudomonasluteola 淺黃假單胞菌。結(jié)果為23000CFU/250mL。ACAS-PT73619-Q695 平板上的菌落在10-3 梯度上，僅生長了綠色菌落，將綠色菌落接綠膿菌素抽提培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24±2h 后進行綠膿菌素實驗，結(jié)果為陽性，則判定該綠色菌落是銅綠假單胞菌。經(jīng)VITEK2 鑒定儀鑒定結(jié)果為99%Probability Pseudomonasaeruginosa 銅綠假單胞菌。結(jié)果為14000CFU/250mL。

3 包裝飲用水銅綠假單胞菌的污染的預(yù)防措施

3.1 車間環(huán)境控制

銅綠假單胞菌分布廣泛，對惡劣環(huán)境有較強的抵抗力，故企業(yè)應(yīng)盡量保證車間干燥無積水，建議企業(yè)采用密閉管網(wǎng)排水，并加強車間通風(fēng)排氣。同時，班前班后應(yīng)進行清洗消毒等以防止細菌滋生。

3.2 過程控制

企業(yè)應(yīng)建立生產(chǎn)過程管理制度——對生產(chǎn)過程中水質(zhì)的處理、配料、殺菌、灌裝、封口、清洗消毒和儲運等環(huán)節(jié)產(chǎn)品的質(zhì)量安全進行全面管控。此外，還應(yīng)定期對石英砂過濾器、活性炭過濾器、保安過濾器、精密過濾器等設(shè)備的水體過濾效果進監(jiān)測和記錄。

生產(chǎn)過程中，品管部門還應(yīng)按規(guī)定定期開展環(huán)境的微生物監(jiān)控、檢測洗滌劑和消毒劑的濃度、驗證容器及蓋的清洗消毒效果、消毒劑殘留等情況，并記錄保存。由于不同種類的消毒劑對不同種類微生物的殺滅時間、使用濃度、作用效果不盡相同，且銅綠假單胞菌具有較強的耐藥性，所以需采用兩種或兩種以上的消毒劑品種，并適當(dāng)增加使用濃度才能起到較好的滅菌效果[2]。

4 結(jié)語

近年來，我國愈加重視食品安全的重要性，相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和制度也日益完善。企業(yè)作為產(chǎn)品質(zhì)量的第一責(zé)任人，必須強化責(zé)任意識，嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)法律法規(guī)的要求，加強內(nèi)部管理，保證產(chǎn)品質(zhì)量，讓消費者買得放心，吃得放心。