喬德瑞，張曉雋

（1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600；2.河南六和飼料有限公司，河南焦作 454350）

豬卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精已被廣泛研究。卵母細(xì)胞成熟是體外生產(chǎn)系統(tǒng)中的關(guān)鍵步驟，它可以影響細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而影響胎兒發(fā)育和后代健康。但體外成熟的卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，發(fā)育能力下降，表明體外成熟的卵母細(xì)胞仍處于次優(yōu)狀態(tài)。因此，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行一定的改善有助于提高卵母細(xì)胞體外成熟效率。氨基酸在大多數(shù)卵細(xì)胞成熟和胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基中均有添加，因?yàn)樗鼈兙哂卸喾N生理功能，包括蛋白質(zhì)和核苷酸的合成能源供應(yīng)，抗?jié)B透休克、氧化應(yīng)激，pH 調(diào)節(jié)（Lane，2011）。氨基酸，尤其是谷氨酰胺的自發(fā)降解和分解代謝可導(dǎo)致氨的產(chǎn)生，這對(duì)活細(xì)胞在體內(nèi)和體外都有毒（沈偉濤和魏婷，2018）。培養(yǎng)基中氨的存在導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH 降低，減少氧化磷酸化和囊胚細(xì)胞數(shù)，最終改變胎兒發(fā)育和增長(zhǎng)率（Zander 等，2006）。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加二肽直接供哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外使用可避免谷氨酰胺的毒性作用，有研究表明，谷氨酰胺可以被L- 丙氨酰-L- 谷氨酰胺和L- 甘氨酰-L-谷氨酰胺取代，以達(dá)到小鼠胚胎發(fā)育水平的提高（Biggers，2004）。二肽在卵母細(xì)胞成熟和豬精子頂體反應(yīng)中起重要作用（Tareq 等，2008）。雖然上述研究報(bào)道了二肽在胚胎發(fā)育中的重要性，但關(guān)于二肽（如甘氨酰谷氨酰胺或丙氨酰谷氨酰胺）對(duì)離體豬胚胎發(fā)育的直接影響數(shù)據(jù)有限。因此，本研究旨在探討單獨(dú)的二肽或聯(lián)合使用對(duì)豬卵母細(xì)胞離體成熟、受精和發(fā)育及對(duì)培養(yǎng)基中氨積累的影響。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞的恢復(fù)和體外成熟 從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)收集母豬卵巢，收集后1 ～3 h 于30 ～35℃條件下補(bǔ)充100 IU/mL 青霉素和100 mg/mL 硫酸鏈霉素的生理鹽水保存。參考劉曉鵬和王華巖（2016）的研究方法分離、收集及培養(yǎng)卵母細(xì)胞。在豬胚胎細(xì)胞培養(yǎng)液中用不同濃度的氨基酸及二肽組合處理胚胎，對(duì)照組為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，T1 ～T6組分別做如下處理：T1 組添加1 mmol 谷氨酰胺、T2 組加入1 mmol 谷氨酸、T3 組加入2 mmol 丙氨酰谷氨酰胺、T4 組加入2 mmol 甘氨酰谷氨酰胺、T5 組2 mmol 丙氨酰谷氨酰胺+2 mmol 甘氨酰谷氨酰胺、T6 組1 mmol 谷氨酰胺+1 mmol 谷氨酸。

1.2 精子準(zhǔn)備、體外受精及胚胎細(xì)胞數(shù)評(píng)估 參考Tareq 等（2007）的研究方法進(jìn)行體外受精。根據(jù)Hunter 和Polge（1996）所述的方法評(píng)估卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂階段。

1.3 放射性標(biāo)記葡萄糖的摻入、氧化及氨氮濃度參考Tareq 等（2005）的方法測(cè)定培養(yǎng)基中氨氮濃度。放射性底物14C- 葡萄糖的標(biāo)記、摻入及氧化測(cè)定參考Tsujii 等（2009）的研究方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 卵母細(xì)胞隨機(jī)分布于各組，每組5 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 軟件單因素方差統(tǒng)計(jì)模型，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟和受精率的影響由表1 可知，卵母細(xì)胞分裂中期成熟率及單精受精卵和精原細(xì)胞受精率在丙氨酰谷氨酰胺組、甘氨酰谷氨酰胺組及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組表現(xiàn)最高（P ＜0.05）。與丙氨酰谷氨酰胺或甘氨酰谷氨酰胺單獨(dú)使用相比，聯(lián)合使用組顯著提高了卵母細(xì)胞分裂中期成熟率、單精受精卵和精原細(xì)胞受精率（P ＜0.05）。

2.2 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響 由表2 可知，聯(lián)合使用丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺顯著提高了卵母細(xì)胞成熟和14C- 葡萄糖的摻入和氧化（P ＜0.05），而對(duì)照組與谷氨酰胺、谷氨酸及聯(lián)合使用谷氨酰胺和谷氨酸對(duì)卵母細(xì)胞成熟指標(biāo)的影響無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。此外丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺聯(lián)合使用組卵母細(xì)胞成熟與受精過(guò)程中培養(yǎng)液氨氮濃度表現(xiàn)最低（P＜0.05）。

2.3 二肽對(duì)卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育及胚胎14C- 葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響 由表3 可知，丙氨酰谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組胚胎發(fā)育2 ～4 個(gè)、8 ～16 個(gè)及桑椹胚和囊胚數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05），同時(shí)丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組胚胎發(fā)育2 ～4 個(gè)、8 ～16 個(gè)及桑椹胚和囊胚數(shù)顯著高于丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺組（P ＜0.05）。

由表4 可知，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組2 細(xì)胞和囊胚14C- 葡萄糖摻入、氧化量顯著高于對(duì)照組，而氨氮濃度顯著低于對(duì)照組（P ＜0.05）。

表1 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟和受精率的影響

表2 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟和受精過(guò)程14C- 葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響

表3 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響

2.4 二肽對(duì)囊胚細(xì)胞數(shù)量的影響 由表5 可知，丙氨酰谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），同時(shí)丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)顯著高于其他各組（P ＜0.05）。

表4 二肽對(duì)豬卵母細(xì)胞胚胎14C-葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響

表5 二肽對(duì)囊胚細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺使卵母細(xì)胞成熟、授精和胚泡階段氨氮濃度較對(duì)照組分別降低了120、70 和100 μmol，其中本研究中氨基酸和二肽的最佳濃度與豬卵母細(xì)胞和精子的最佳濃度相似（Tareq 等，2008）。這些結(jié)果表明，對(duì)氨的敏感性取決于卵母細(xì)胞或胚胎的發(fā)育階段，可能與卵丘細(xì)胞的存在有關(guān)。Yuan 和Krisher（2010）提出，氨對(duì)卵母細(xì)胞分離中期有不利影響，而氨是卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中產(chǎn)生的。卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中卵丘細(xì)胞起至關(guān)重要的作用，因?yàn)槁亚鸺?xì)胞的體外生長(zhǎng)和代謝受類(lèi)似于卵泡液中氨濃度的改變，這些卵丘細(xì)胞支持卵母細(xì)胞體外成熟的能力受到損害。另外，卵丘細(xì)胞可以減少卵母細(xì)胞直接接觸到氨的量，阻止培養(yǎng)基中的氨通過(guò)縫隙連接轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞（Tareq 等，2007）。本數(shù)據(jù)表明，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺的添加對(duì)培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞分離中期、單精受精卵和精原細(xì)胞形成、成熟和受精的影響最大。

體外研究證明，氨基酸在體內(nèi)支持正常的著床前發(fā)育。氨基酸的自然降解和分解會(huì)形成吡咯烷酮碳酸和潛在的有害氨。氨對(duì)活細(xì)胞的毒性在體內(nèi)外都是公認(rèn)的。具體來(lái)說(shuō)，氨含量的增加降低了pH，增加了滲透壓，導(dǎo)致精子活力逐漸喪失，并降低了豬卵母細(xì)胞分裂中期和單精受精的速率（Tareq 等，2007）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與其他處理組相比，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺處理減少了氨的積累，對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精和發(fā)育成囊胚方面有重要作用。

一些研究已經(jīng)證明，哺乳動(dòng)物葡萄糖代謝對(duì)植入前胚胎的影響，對(duì)豬胚胎的營(yíng)養(yǎng)攝取研究表明，胚胎在發(fā)育的所有階段都消耗葡萄糖并產(chǎn)生乳酸。因此，含葡萄糖的培養(yǎng)基常被用于體外培養(yǎng)豬胚胎。葡萄糖的結(jié)合和氧化是卵母細(xì)胞活力和產(chǎn)生卵子的指標(biāo)（Tsujii 等，2009）。本研究丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺處理的卵母細(xì)胞在成熟、受精、細(xì)胞和囊胚階段的14C 標(biāo)記葡萄糖的摻入率和氧化率明顯高于對(duì)照組，這與Tareq等（2012）的研究結(jié)果一致。因此，在胚胎發(fā)育階段，當(dāng)胚胎對(duì)能量的需求較高時(shí)，培養(yǎng)基中的高氨氮可能會(huì)降低胚胎細(xì)胞對(duì)ATP 的可利用性，導(dǎo)致退化卵增多，囊胚發(fā)育階段減少。但丙氨酰谷氨酰胺+甘氨酰谷氨酰胺產(chǎn)生的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外層細(xì)胞數(shù)量的顯著增加，表明丙氨酸和甘氨酸是通過(guò)一種未知的機(jī)制起主要作用（Tareq 等，2012）。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，二肽參與調(diào)控豬卵母細(xì)胞的成熟、受精和胚胎發(fā)育，其中將丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺結(jié)合可以降低氨積累，提高豬胚胎細(xì)胞成熟、受精、胚胎發(fā)育和葡萄糖的攝入速度。