劉倩峰 龐 超 楊佩璇 李慶星 牛英豪

口腔鱗狀細(xì)胞癌（口腔鱗癌）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移和放化療耐受是口腔鱗癌致死的主要原因[1，2]。因此，闡明口腔鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和放化療耐受的分子調(diào)控機(jī)制將為設(shè)計診斷用生物標(biāo)志物、驗證藥物治療的分子靶點和明確切實有效的處理方案奠定實驗基礎(chǔ)。作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）家族成員之一，細(xì)胞周期素依賴性激酶10 在多種癌癥中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，CDK10 表達(dá)缺失造成腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)惡性生長并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3，4]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測在口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白的表達(dá)狀態(tài)，研究CDK10 表達(dá)與臨床病理參數(shù)和生存期之間的相關(guān)性。

資料和方法

1.臨床樣本：收集在20011 年11 月至2012 年12 月收治的原發(fā)口腔鱗癌組織手術(shù)標(biāo)本208 例，整理臨床病理資料并進(jìn)行電話回訪?；颊吣挲g最大71歲，最小32 歲，中位年齡50.2 歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis，TNM）標(biāo)準(zhǔn)（第六版）分期。入組標(biāo)準(zhǔn)：①樣本均經(jīng)病理組織學(xué)確診；②臨床病理和預(yù)后資料齊全；③術(shù)前未行放化療和生物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其它種類惡性腫瘤。

2.主要試劑：兔抗人多克隆抗體（CDK10、P53 和Ki67）購自美國Santa Cruz 公司，EnVision 通用性試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司，DAB 試劑購自中山金橋生物技術(shù)有限公司。

3. 免疫組織化學(xué)染色：用4%中性甲醛固定樣本，石蠟包埋后4μm 厚度切片，二甲苯逐級脫蠟，梯度乙醇回水；3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶；采用10mmol/L EDTA（pH 9.0）微波抗原修復(fù)；一抗（1:200 稀釋）4℃過夜；按EnVision 二步法說明書進(jìn)行染色，DAB 顯色10min，蘇木素復(fù)染2min，鹽酸乙醇分化；脫水，透明后封固。PBS 替代一抗作為空白對照。

4. 免疫組化染色判定：CDK10 表達(dá)狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)如下[5]：以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色至棕黃色顆粒為陽性信號。采用染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)記分乘積的計算規(guī)則。免疫組化染色強(qiáng)度判斷方法：0 分為沒有著色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。高倍鏡下（×400）選擇10 個視野計算癌細(xì)胞的陽性染色百分率：0 分為無染色，1 分為1%～25%細(xì)胞2 分為6%～50%染色，3 分為51%～75%，4 分為76%～100%。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)與陽性細(xì)胞百分率記分乘積為最終評分，低表達(dá)為1～3 分，陽性染色定義為為≥4 分。P53 和Ki67 表達(dá)狀態(tài)判定：細(xì)胞核無著色為0 分、1 分為＜1%細(xì)胞染色、2 分為1%～10%、3 分為11%～33%細(xì)胞染色、4 分為34%～66%細(xì)胞染色、5 分為≥67%細(xì)胞染色，染色強(qiáng)度按無、弱、中、強(qiáng)分別評為0、1、2、3 分。二者之和，≤2 分為染色陰性，＞2 分為染色陽性。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存期分析采用Kaplan-Meier 法和log rank 檢驗。單因素分析和多因素分析采用COX 風(fēng)險比例模型，確立影響患者的獨立預(yù)后因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CDK10 蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的聯(lián)系：口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核（圖1）。在208 例臨床樣本中103 例為CDK10 為呈陰性表達(dá)（49.5%），105 例呈陽性表達(dá)（50.5%）。CDK10 表達(dá)在臨床TNM 分期Ⅲ/Ⅳ高于Ⅰ/Ⅱ期期（P＝0.035），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N1-N3）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N0）（P＝0.042），在T3/T4 組高于T1/T2 組（P＝0.019）。CDK10 表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分級、P53 和Ki67 表達(dá)狀態(tài)等臨床病理參數(shù)無關(guān)（表1）。

2.CDK10 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系：應(yīng)用Kaplan-Meier 法研究CDK10 表達(dá)與患者總生存期之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CDK10 在癌組織中陰性表達(dá)的患者總生存期顯著高于CDK10 陽性表達(dá)的患者（P＝0.003）（圖2）。

圖1 口腔鱗癌組織中CDK10 蛋白陽性表達(dá)（EnVision×200）

表1 口腔鱗癌組織中CDK10 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3.CDK10 表達(dá)與口腔鱗癌預(yù)后參數(shù)的關(guān)系：COX 風(fēng)險比例模型分析影響口腔鱗癌患者總生存期之間的因素。單因素分析顯示，CDK10 表達(dá)（P＝0.004）、性別（P＝0.010）、組織學(xué)分級（P＜0.001）、臨床TNM 分期（P＜0.001）、T 分期（P＜0.001）、N 分期（P＜0.001）、P53 表達(dá)（P＝0.027）與患者總生存期相關(guān)。多因素分析顯示，組織學(xué)分級（P＝0.029）和臨床TNM 分期（P＝0.070）是影響患者總生存期的獨立因素。

圖2 Kaplan-Meier 法分析CDK10 表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系（P＝0.003）

表2 COX 風(fēng)險比例模型單因素和多因素分析

討 論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈迅速上升，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的最主要原因之一。人乳頭瘤狀病毒感染、吸煙均是提高口腔鱗癌的流行病學(xué)危險因素。不同的病理性因素導(dǎo)致的口腔鱗狀上皮細(xì)胞的基因調(diào)控異常，包括細(xì)胞基因突變、DNA 錯配修復(fù)和細(xì)胞周期改變，多種因素共同導(dǎo)致口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。近年來研究口腔鱗癌發(fā)病和進(jìn)展的分子機(jī)制成為預(yù)防和臨床治療口腔鱗癌的主要著眼點。細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK）與細(xì)胞周期性蛋白（cyclins）、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）三者相互作用成為調(diào)控真核細(xì)胞周期的關(guān)鍵機(jī)制。CDK10 基因全長9.7Kb，含有13 個外顯子，定位于人染色體16q24.3，編碼360 個氨基酸，其蛋白分子量大約40kD[6～8]。CDK10 被證明是一類參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并廣泛表達(dá)于人體組織器官的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與神經(jīng)發(fā)育、肝臟纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理與病理過程。

研究發(fā)現(xiàn)依賴于雌激素受體（estrogen receptor）的存在，CDK10 基因失活誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞對選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫西芬出現(xiàn)耐藥[9，10]。在乳腺癌、肝癌和膽管癌中的研究中證實CDK10 在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平減弱，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良總生存期密切相關(guān)，可作為預(yù)后評估的獨立因素[11～13]。最新研究表明，胃癌組織中CDK10 表達(dá)缺失同胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級和不良總生存期顯著相關(guān)，多因素分析顯示CDK10 表達(dá)可作為預(yù)后判斷的獨立因子[14]。此外，功能試驗證實肝細(xì)胞癌中miR-3127-5p通過靶向抑制抑癌基因Cdk10 從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲及遷移[15]。在膠質(zhì)瘤的一項研究中，CDK10 通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail 的表達(dá)而影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲[16]。后續(xù)研究明確了CDK10 與ETS2 相互作用的分子機(jī)制，即活化型CDK10（CDK10/cyclinM）磷酸化ETS2 使其被蛋白酶體識別并降解[17]。

本研究應(yīng)用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)CDK10 表達(dá)與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、患者性別、組織學(xué)分級顯著相關(guān)，提示CDK10 是參與口腔鱗癌發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。結(jié)合隨訪資料進(jìn)一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)CDK10 表達(dá)高的口腔鱗癌患者總生存期時間減少。這些研究結(jié)果提示，CDK10 可能在口腔鱗癌進(jìn)展中發(fā)揮類似于癌基因的作用，這同以往在其他類型腫瘤中的研究不同。CDK10 作為一種獨特的細(xì)胞周期素依賴性激酶，在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用具有差異性，這可能和腫瘤組織來源和腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的不同有關(guān)。擴(kuò)大臨床檢測樣本量、進(jìn)行細(xì)胞與動物實驗并深入分析其分子調(diào)控機(jī)制是探索CDK10 在口腔鱗癌中具體作用的研究方向。

此外，Ki67 作為一種與有絲分裂密切相關(guān)的刺激細(xì)胞增生相關(guān)核抗原因子，是重要的癌癥診斷和生存期評估的分子參數(shù)[18～20]。但是本研究顯示CDK10表達(dá)與Ki67 表達(dá)無顯著相關(guān)，可能因為CDK10 調(diào)控的分子通路在不同種類腫瘤中表現(xiàn)差異。p53 是已發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵的腫瘤抑制基因，通過眾多不同的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑調(diào)節(jié)細(xì)胞正常細(xì)胞活動。此外，p53基因與細(xì)胞內(nèi)其它信號調(diào)控因子的相關(guān)作用，能夠通過其磷酸化、乙?；凹谆刃揎椷^程，提高癌細(xì)胞的錯配修復(fù)能力，阻斷DNA 的復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞的發(fā)生凋亡。在人類超過半數(shù)的多種腫瘤組織中出現(xiàn)了異常的p53 基因突變，被認(rèn)為是癌癥發(fā)生過程中最重要的分子改變[21～23]。，由于p53 基因突變后其三維分子構(gòu)象出現(xiàn)變化，喪失了其正常調(diào)控細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和核酸修復(fù)的功能。本研究顯示CDK10 表達(dá)與p53 表達(dá)無顯著相關(guān)，提示CDK10作為一種獨特的分子可能發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用。在對于CDK10 的研究中不能單獨抽象地觀察其基因調(diào)控的復(fù)雜作用，而是應(yīng)該從全局整合其功能。

綜上所述，CDK10 表達(dá)同口腔鱗癌臨床病理特征和患者預(yù)后密切相關(guān)，可能是參與口腔鱗癌發(fā)展的遺傳事件。闡明CDK10 表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理特定關(guān)系以及對患者生存期的，不僅有助于改善口腔鱗癌臨床診斷的準(zhǔn)確性，而且可以提供更為敏感高效的口腔鱗癌預(yù)后評價指標(biāo)，指導(dǎo)個體化治療方案醫(yī)生的制定，從而改善口腔鱗癌的臨床治療現(xiàn)狀。