徐 繁， 李 瀟， 李青山， 肖 旭， 張圣林， 姜海軍， 趙 博， 肇 爽

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

乳腺癌為女性常見惡性腫瘤，而化療為重要治療手段之一，蒽環(huán)類藥物為乳腺癌化療過程中常見藥物，以多柔比星(doxorubicin，DOX)為代表于20世紀70年代初開始應用于臨床，但約10%的患者在停止化療近10年后還會出現(xiàn)心臟疾病，由于心肌細胞為永久性細胞，被破壞后無法再生，若心肌細胞受到損傷，可能引起一系列不良癥狀，嚴重可危及生命，蒽環(huán)類藥物致心臟毒性過程中細胞凋亡可能是其主要機制之一，而目前臨床上常用維生素C、E聯(lián)合蒽環(huán)類藥物來減輕心臟毒性，但效果欠佳，因此尋找一個方便有效的藥物成為研究熱點。靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLPS)是中藥靈芝的主要活性成分，具有清除氧自由基、抗肌炎、保護心臟作用，在本研究中我們用GLPS干預DOX致大鼠H9C2心肌細胞損傷，以探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料:RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)，購于HyClone Laboratories公司；Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(兔來源多抗)、二抗(羊抗兔IgG HRP抗體)，購于Proteintech公司(中國武漢)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、AV-PI檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，多柔比星、靈芝多糖(純度99%)購于北京康泰合元生物公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組:H9C2細胞用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，穩(wěn)定后調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，將細胞分為5組，分別為：對照組、GLPS高劑量組、DOX組、GLPS低劑量+DOX組，GLPS高劑量+DOX組。細胞處理方法：對照組細胞只加培養(yǎng)基，GLPS高劑量組加入100ug/mL的GLPS與H9C2細胞共培養(yǎng)8h；GLPS低劑量+DOX組、GLPS高劑量+DOX組細胞分別加入50ug/mL、100ug/mL的GLPS與H9C2細胞共培養(yǎng)8h，然后在兩組均加入1μM多柔比星繼續(xù)共培養(yǎng)24h；DOX組細胞僅加入1μM多柔比星共培養(yǎng)24h，收集各組細胞待用。

1.3AV-PI法檢測H9C2細胞凋亡:收集各組細胞重懸于0.3mL結(jié)合緩沖液中,加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化吡啶(PI)染液, 混勻, 室溫避光孵育30min，將每管用緩沖液補足至500ul后上流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.4Western blot分析:收集各組細胞，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取20ul蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將已分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1h，分別加入Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(用一抗稀釋液將一抗按照1：1000稀釋)4℃孵育過夜，再分別加入二抗(用二抗稀釋液將二抗按照1：2000稀釋)室溫下2h，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色, 進行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1H9C2細胞的凋亡率:AV-PI雙染流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，GLPS高劑量組與對照組相比細胞凋亡率無統(tǒng)計學意義；DOX組細胞凋亡率與對照組相比升高42.98%(P<0.05)；與DOX組對比，50ug/mL和100ug/mL的GLPS預處理H9C2細胞，凋亡率分別降低6.22%和15.36%(P<0.05)，具有統(tǒng)計學差異。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡率

2.2Western blot 法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白的表達水平:DOX組H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達明顯高于對照組，Bcl-2/Bax比值明顯低于對照組；GLPS低、高劑量+DOX組H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達明顯低于DOX組，Bcl-2/Bax比值明顯高于DOX組。見圖2。

圖2 (A)H9C2細胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達；(B)H9C2細胞Bax、Bcl-2蛋白表達；(C)各組H9C2細胞中Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP相對表達量；(D)各組H9C2細胞中Bax / Bcl-2蛋白表達水平比值的統(tǒng)計圖

3 討 論

蒽環(huán)類藥物為臨床常用抗腫瘤藥物，而多柔比星為蒽環(huán)類藥物的代表藥物之一，其對心肌組織具有強力親和性，引起心臟疾病，可能機制為藥物進入心肌組織后使氧自由基堆積，抑制核酸及蛋白質(zhì)合成，加速心肌細胞凋亡[1]，而如何將藥物所致心臟毒性降到最低成為研究熱點。靈芝中含有400多種不同活性物質(zhì)，而靈芝多糖是其中質(zhì)量比重最大的成分，近幾年來對其研究眾多。已有報道，靈芝多糖具有抗氧化、抗腫瘤、保護心臟等作用，但是否可緩解藥物所致心臟毒性尚無報道。本研究采用GLPS預處理后用DOX誘導心肌細胞損傷，明確其功效。結(jié)果表明DOX可以增加大鼠心肌細胞凋亡，而靈芝多糖預處理后，心肌細胞凋亡率及促凋亡蛋白表達明顯降低，抗凋亡蛋白表達率明顯升高，提示我們，GLPS在一定程度上可以減輕DOX所致的心肌損傷，具有保護心肌的作用。

氧化應激會使ROS過多積累在細胞內(nèi)，過量的ROS可損傷線粒體，從而介導線粒體凋亡途徑；本實驗之前預實驗部分結(jié)果提示DOX干預后心肌細胞內(nèi)ROS及細胞凋亡率顯著升高，考慮DOX可使氧自由基生成增多，致細胞凋亡率升高，而GLPS可對此過程產(chǎn)生部分緩解作用。

caspase家族蛋白是死亡受體途徑(細胞外途徑)和線粒體途徑(細胞內(nèi)途徑)的共同終末途徑[2]。Caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的核心步驟，cleaved PARP是細胞凋亡的標志，Caspase-8是啟動細胞凋亡的關(guān)鍵。Bax和Bcl-2是Bcl家族成員，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的比值對凋亡途徑起重要調(diào)控作用[3,4]。Bcl-2/Bax比值的增加能夠激活下游細胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一Caspase-3的表達，進而誘導細胞凋亡[5]。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)GLPS預處理8h后下調(diào)了Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP的表達，Bcl-2/Bax表達率明顯升高。綜上說明,靈芝多糖可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白,抑制活化后的caspase-3酶解切割PARP得到cleaved PARP,抑制DOX所致心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有保護作用。

綜上所述，靈芝多糖可以減輕蒽環(huán)類藥物所致心肌細胞凋亡的發(fā)生,發(fā)揮保護心肌細胞的作用,然而這僅僅是眾多機制中的一個環(huán)節(jié),為針對多因素綜合干預的藥物或方法的研究提供一定的理論基礎。