蔣文斌，孫梁博，杜燁湘，肖云華，黎伯勝，閆小晶，吳亞冉，連繼勤，何鳳田

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室1，藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系臨床生物化學(xué)教研室2，第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科3

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常見的人類惡性腫瘤之一，也是全世界癌癥死亡的主要原因之一。臨床上除手術(shù)、放療、全身化療等治療手段外，經(jīng)動脈插管栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)也是中晚期肝癌治療的首選方法。作為一種常規(guī)的抗腫瘤藥，表柔比星(epirubicin, EPI)常被用于肝癌TACE化療的一線治療方案。然而，在長期的表柔比星單藥治療過程中，HCC細(xì)胞會對表柔比星耐藥，從而導(dǎo)致HCC的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。因此，尋找增強(qiáng)表柔比星殺傷HCC效果的策略對于改善HCC基于表柔比星的化療具有重要的臨床意義。

左旋棉酚[(-)-gossypol,(-)-G]是棉籽提取物中的一種有效成分，由于能夠抑制精子發(fā)生和精子活動，曾在臨床上被用作男性避孕藥。而近年來，左旋棉酚被證明對肝癌細(xì)胞在內(nèi)的多種癌細(xì)胞系具有抗癌作用。除單獨(dú)使用發(fā)揮一定抗癌作用外，左旋棉酚還可增敏多種化療藥物的抗癌效應(yīng)，而左旋棉酚是否能夠增敏表柔比星尚不清楚。因此，本研究將探討左旋棉酚能否增強(qiáng)表柔比星殺傷HCC細(xì)胞的能力及其可能的機(jī)制，以期為臨床上提升表柔比星對HCC的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

商品化的人來源HCC細(xì)胞系Hep3B、HuH7購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存。0.25%胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胎牛血清購于江蘇依科賽公司；表柔比星購于美國Selleck公司；左旋棉酚購于美國Sigma公司；CCK-8試劑購于美國MedChem Express公司；凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF購于江蘇碧云天公司；PARP、XIAP抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；Tubulin抗體購于德國Novus公司；lipofectamine 3000脂質(zhì)體、山羊抗兔二抗購于美國Thermo公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；ECL發(fā)光液購于重慶葆光生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

Hep3B細(xì)胞用含10% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HuH7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，2種細(xì)胞均置于5% CO、37 ℃的條件下靜置培養(yǎng)。每2～3天更換1次培養(yǎng)液或進(jìn)行傳代。當(dāng)重新鋪板后的細(xì)胞進(jìn)入到對數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。藥物作用24 h或48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在2個EP管中加入適量等體積無血清培養(yǎng)基，然后向其中一管加入1份體積的質(zhì)粒/siRNA，向另一管加入2份體積的lipofectamine 3000，各自混勻后靜置5 min?；旌仙鲜?管液體并在室溫下靜置20 min，隨后將混合液加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。待細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，移除含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基并進(jìn)行后續(xù)處理。pEBB-XIAP及對照空載質(zhì)粒購于美國Addgene公司；XIAP及對照的siRNA由北京擎科生物公司合成。si-XIAP序列為：正義鏈5′-AAGUGGUAGUCCUGUUUCAGCUU-3′；反義鏈5′-AAGCUGAAACAGGACUACCACUU-3′。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞存活

將3 000個/孔細(xì)胞接種在96孔板中培養(yǎng)24 h，隨后對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理。藥物處理48 h后，棄去培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL含10% CCK-8的相應(yīng)培養(yǎng)基，然后置于培養(yǎng)箱中4 h。最后測定各孔的光密度值[

D

(450)]，并計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

HCC細(xì)胞鋪于6孔板中，藥物處理24 h，收集細(xì)胞并漂洗，用含Annexin V和PI的緩沖液重懸細(xì)胞并避光15 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Annexin V單陽為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI雙陽為晚期凋亡細(xì)胞。以各組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的總和作為總的細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

用含有PMSF的細(xì)胞裂解液提取經(jīng)藥物處理24 h后的各組細(xì)胞中的總蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后變性，經(jīng)10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。蛋白在濃縮膠中以80 V的電壓進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入分離膠后以120 V的條件電泳1 h。隨后用半干轉(zhuǎn)印儀以恒流1.5 A的條件轉(zhuǎn)膜30 min，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，并用5%蛋白封閉液常溫封閉1 h。TBST洗膜后，用1∶1 000的相應(yīng)抗體工作液4 ℃下孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次后，用1∶10 000稀釋的山羊抗兔二抗工作液在室溫條件下孵育1 h。孵育結(jié)束后，再用TBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光儀中對膜進(jìn)行曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 左旋棉酚聯(lián)合表柔比星能顯著抑制HCC細(xì)胞的存活

如圖1所示，表柔比星以0.25 μmol/L濃度單獨(dú)處理Hep3B細(xì)胞(圖1A)、HuH7細(xì)胞(圖1B)48 h，細(xì)胞生長受到明顯抑制。左旋棉酚單獨(dú)處理Hep3B細(xì)胞(圖1C)、HuH7細(xì)胞(圖1D)48 h，在10 μmol/L濃度時(shí)，細(xì)胞生長明顯受到抑制；而在5 μmol/L濃度時(shí)，細(xì)胞生長雖然受到抑制，但與溶劑對照組相比，該差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5 μmol/L濃度探討左旋棉酚對表柔比星抗HCC的增強(qiáng)作用。左旋棉酚(5 μmol/L)和表柔比星(0.25 μmol/L)聯(lián)合處理HCC細(xì)胞48 h會更加顯著抑制細(xì)胞的存活(圖1E、F)，與表柔比星組相比，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。以上結(jié)果提示，左旋棉酚可增強(qiáng)表柔比星殺傷HCC細(xì)胞的能力。

A：表柔比星單藥處理Hep3B細(xì)胞系48 h后存活情況；B：表柔比星單藥處理HuH7細(xì)胞系48 h后存活情況；C：左旋棉酚單藥處理Hep3B細(xì)胞系48 h后存活情況；D：左旋棉酚單藥處理HuH7細(xì)胞系48 h后存活情況；E：聯(lián)合用藥處理Hep3B細(xì)胞系48 h后存活情況；F：聯(lián)合用藥處理HuH7細(xì)胞系48 h后存活情況 a：P<0.05，與溶劑對照組(0 μmol/L)比較；b：P<0.05，與表柔比星處理組比較

2.2 左旋棉酚聯(lián)合表柔比星能顯著誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示(圖2A)：HCC細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，與溶劑對照組和單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(

P

<0.05)。而經(jīng)Western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，左旋棉酚聯(lián)合表柔比星處理HCC細(xì)胞24 h，能顯著誘導(dǎo)凋亡相關(guān)分子聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]的剪切(圖2B～D)，表明該兩藥聯(lián)合可顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞的凋亡。

1：溶劑對照組；2：左旋棉酚處理組；3：表柔比星處理組；4：聯(lián)合用藥組 a：P<0.05，與聯(lián)合用藥組比較

2.3 左旋棉酚可抑制表柔比星誘導(dǎo)的X連鎖凋亡抑制蛋白

進(jìn)一步探究左旋棉酚增強(qiáng)表柔比星誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞生長的可能機(jī)制，分析各組藥物對HCC細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：表柔比星會誘導(dǎo)HCC細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)的表達(dá)上調(diào)；而聯(lián)合使用左旋棉酚后，表柔比星對XIAP的誘導(dǎo)則會受到抑制(圖3)。

2.4 沉默X連鎖凋亡抑制蛋白可促進(jìn)表柔比星誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖

為了探究XIAP對表柔比星抗HCC的影響，利用siRNA干擾技術(shù)沉默XIAP后發(fā)現(xiàn)：沉默XIAP可顯著增強(qiáng)表柔比星對HCC細(xì)胞的殺傷作用(圖4A、B)，同時(shí)能顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞中PARP的剪切(圖4C～E)。

2.5 過表達(dá)X連鎖凋亡抑制蛋白削弱左旋棉酚對表柔比星殺傷HCC細(xì)胞能力的增強(qiáng)作用

分別在HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒，然后經(jīng)左旋棉酚和表柔比星聯(lián)合處理細(xì)胞，過表達(dá)XIAP顯著削弱了左旋棉酚增強(qiáng)表柔比星對HCC細(xì)胞殺傷的作用(圖5A、B)，同時(shí)HCC細(xì)胞中PARP的剪切也受到了抑制(圖5C、E)。以上結(jié)果提示，XIAP是左旋棉酚增強(qiáng)表柔比星抗HCC的關(guān)鍵分子。

2.6 左旋棉酚可抑制表柔比星誘導(dǎo)的真核起始因子4E的磷酸化

表柔比星處理HCC細(xì)胞可促進(jìn)eIF4E的磷酸化，而左旋棉酚可顯著減弱表柔比星誘導(dǎo)的eIF4E的磷酸化(圖6A～C)。提示左旋棉酚抑制表柔比星誘導(dǎo)的XIAP上調(diào)表達(dá)是通過抑制其IRES依賴的翻譯起始而實(shí)現(xiàn)的。

1：溶劑對照組；2：左旋棉酚處理組；3：表柔比星處理組；4：聯(lián)合用藥組 a：P<0.05，與表柔比星處理組比較

3 討論

在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌導(dǎo)致了大量的癌癥相關(guān)死亡，盡管早期的HCC可以進(jìn)行手術(shù)切除，但80%的HCC患者術(shù)后仍會出現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)。此外，大多數(shù)HCC患者診斷時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會。近年來研究表明，表柔比星聯(lián)合TACE化療是一種有效且安全的治療手段，尤其對不能切除HCC的患者來說，可以提高生存率。然而，在長期的表柔比星單藥治療過程中，腫瘤細(xì)胞對表柔比星會產(chǎn)生耐藥性，從而影響治療的成功率和臨床結(jié)局。有研究表明，在殺傷多種腫瘤時(shí)，表柔比星會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞顯著上調(diào)抗凋亡蛋白survivin的水平，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對表柔比星的敏感性降低。而本研究證實(shí)，表柔比星還可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞中抗凋亡分子XIAP的上調(diào)表達(dá)，從而引起HCC細(xì)胞對表柔比星殺傷作用的抵抗；而沉默XIAP的表達(dá)可促進(jìn)表柔比星對HCC細(xì)胞的殺傷作用。這說明XIAP可能在HCC細(xì)胞抵抗表柔比星殺傷的過程中起重要作用。

左旋棉酚是一種從棉籽中提取的黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，雖然最初被用作男性避孕藥及治療女性子宮功能性出血、子宮內(nèi)膜異位癥的藥物。但近年研究表明，左旋棉酚對HCC在內(nèi)的多種癌癥細(xì)胞系具有抗癌作用，是一種有效的天然抗癌劑，現(xiàn)在正處于2期/3期臨床試驗(yàn)階段。普遍認(rèn)為，左旋棉酚可作為BH3的類似物，抑制BH3肽與Bcl-2和Bcl-XL蛋白的結(jié)合，影響B(tài)cl蛋白的抗凋亡作用，從而誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞的生長抑制。然而，除單獨(dú)使用能發(fā)揮一定抗癌作用外，左旋棉酚還可增敏多種化療藥物的抗癌效應(yīng)。例如，在膠質(zhì)瘤中，左旋棉酚可抑制hedgehog/Notch通路而增敏三氧化二砷；在晚期非小細(xì)胞肺癌中，左旋棉酚可抑制脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APE1)，從而增敏紫杉醇和順鉑的抗腫瘤作用；在非小細(xì)胞肺癌中，左旋棉酚可抑制YES相關(guān)蛋白/含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(YAP/TAZ)，從而增敏表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)。更重要的是，左旋棉酚可以在結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制包括XIAP在內(nèi)的多種抗凋亡蛋白的表達(dá)，這暗示其可能具有增敏表柔比星殺傷HCC細(xì)胞的能力。本研究證實(shí)，左旋棉酚在低濃度情況下(5 μmol/L)能夠抑制表柔比星誘導(dǎo)的XIAP上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)表柔比星抗HCC細(xì)胞的能力。通過過表達(dá)XIAP進(jìn)一步證實(shí)，XIAP可阻礙左旋棉酚對表柔比星殺傷HCC細(xì)胞的增強(qiáng)作用，這充分說明XIAP表達(dá)水平的下調(diào)正是左旋棉酚增強(qiáng)表柔比星聯(lián)合殺傷HCC細(xì)胞的關(guān)鍵。那么表柔比星是通過何種方式誘導(dǎo)XIAP的上調(diào)表達(dá)呢？

有研究證實(shí)，XIAP mRNA 具有獨(dú)特的5’-UTR和二級結(jié)構(gòu)，能夠以IRES依賴的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。而這種IRES依賴的翻譯機(jī)制又與eIF4E的磷酸化密不可分。本研究發(fā)現(xiàn)，左旋棉酚可顯著抑制表柔比星誘導(dǎo)的eIF4E磷酸化，這對XIAP的IRES依賴的翻譯至關(guān)重要，因此推測左旋棉酚是通過抑制表柔比星誘導(dǎo)的p-eIF4E，阻礙了XIAP以IRES依賴的方式進(jìn)行翻譯，從而抑制XIAP的表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，左旋棉酚聯(lián)合表柔比星可以顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞Hep3B和HuH7的凋亡并抑制細(xì)胞的存活，而該途徑主要是通過抑制eIF4E的磷酸化和XIAP的上調(diào)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。在表柔比星處理過程中，HCC細(xì)胞的eIF4E被磷酸化，隨后促進(jìn)XIAP以IRES依賴的方式持續(xù)翻譯。而加入左旋棉酚后，eIF4E的磷酸化受到抑制，阻礙了XIAP的持續(xù)翻譯，從而影響到XIAP抗凋亡作用的發(fā)揮，最終促進(jìn)表柔比星誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為左旋棉酚與表柔比星聯(lián)用抗HCC以及表柔比星更好地應(yīng)用于HCC治療等臨床問題提供了理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。