牛雪芳，廖 奎，汪子鈴，侯吉穎，曾 娣，肖含先之，杜坤航，王 璐，王亞平

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學：基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，干細胞與組織工程研究室1；附屬第一醫(yī)院放射治療室2

當歸是中醫(yī)臨床“補血、活血”要藥，當歸多糖(

Angelica

sinensis

polysaccharide, ASP)是其主要藥物活性成分。ASP對機體的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能有明確促進作用，對抗腫瘤和抗輻射損傷也有顯著良好功效。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，ASP既能抑制白血病細胞增殖，誘導其向紅系、粒系方向分化，又能加速受輻射損傷小鼠的造血功能重建，并促進小鼠免疫功能恢復。迄今，ASP對骨髓移植重建小鼠造血功能的機制尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠骨髓移植模型，探討ASP促進骨髓細胞移植后造血重建的生物學機制，旨在為闡釋當歸“補血、活血”的現(xiàn)代生物學機制提供理論依據(jù)，也為當歸的臨床應用提供實驗室資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取10只8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠為供體小鼠。另選取30只同周齡雌性C57BL/6J小鼠為受體小鼠。體質(zhì)量20～25 g，由重慶市醫(yī)學實驗動物中心提供,動物合格證號：SCXK(渝)2007-0001。飼養(yǎng)條件控制在20～25 ℃，自然照明，自由飲水和攝食。

1.2 材料與試劑

當歸多糖購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司(批號為CY130421，甘肅岷縣當歸提取，純度≥95%)；EDU細胞增殖檢測試劑盒(中國銳博生物公司)；基因組DNA提取試劑盒(艾科瑞生物公司)；DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；GM-CSF、IL-3與SCF 的ELISA檢測試劑盒(上海研輝生物)；全自動血液細胞分析儀(邁瑞獸用分析儀，型號：BC-2800vet)。

1.3 小鼠骨髓移植模型構(gòu)建與分組給藥

頸椎脫臼處死供體雄鼠，取股骨，制備骨髓單個核細胞懸液，計數(shù)備用。受體雌鼠放置在有機玻璃照射盒(長16 cm，寬16 cm，高4.3 cm)內(nèi)，給予小鼠X射線全身一次性致死劑量照射(照射距離: 55 cm；劑量率：300 cGy/min；總劑量8.0 Gy)，建立受體小鼠造血衰竭骨髓移植模型。采用簡單隨機化法將受體小鼠分為3組，每組10只。對照組(Ctrl組)：輻射小鼠后6 h內(nèi)，由尾靜脈輸入無菌PBS(0.2 mL/只)；骨髓移植組(BMT組)：輻射后4～6 h內(nèi)由尾靜脈移植入供體鼠骨髓單個核細胞懸液0.2 mL(5×10個/只)，同時給予小鼠腹腔注射PBS(0.2 mL/只×9 d)；骨髓移植+當歸多糖組(TASP組)：供體鼠骨髓單個核細胞移植數(shù)量同骨髓移植組，移植后給予受體鼠腹腔注射ASP(100 mg/kg×9 d)。

1.4 骨髓細胞移植后受體小鼠體質(zhì)量變化

骨髓細胞移植后每天測量BMT組與TASP組小鼠體質(zhì)量，連續(xù)觀察9 d，評價受體小鼠體質(zhì)量變化規(guī)律。

1.5 受體小鼠骨髓細胞與脾集落細胞Y染色體決定基因的檢測

分別取受體小鼠骨髓細胞和脾集落細胞。脾集落細胞的提?。侯i椎脫臼處死受體小鼠，取出脾臟后，摘取肉眼可見脾臟表面的脾集落，置入DMEM培養(yǎng)液中，用注射器針芯研磨脾集落，通過不銹鋼網(wǎng)(100目)過濾研磨液，提取脾集落細胞。PCR分析供體小鼠骨髓細胞和脾集落細胞中的Y染色體性別決定基因(Sry基因)。具體按以下步驟進行，①抽提DNA:制備小鼠骨髓細胞和脾集落細胞懸液，參照基因組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書提取細胞基因組DNA；②PCR擴增:Sry引物序列上游5′-TGTGGTCCCGTGGTGAGAG-3′，下游5′-CTCCAGTCTTGCCTGTATGTG-3′。50 μL的PCR反應體系:上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA 1 μL,

Taq

酶25 μL，RNase free water 22 μL。預變性94 ℃ 30 s；變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；最終延伸72 ℃ 2 min；③擴增物的檢測:取PCR擴增產(chǎn)物3 μL,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)中進行Sry基因片段分析(312 bp),并記錄拍照。

1.6 血常規(guī)的檢測

在移植供體骨髓細胞后第9天，采受體小鼠眼眶血,全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)(WBC、RBC、HGB、PLT數(shù)量)。

1.7 受體鼠股骨有核細胞計數(shù)與細胞周期檢測

移植供體骨髓細胞后第9天，處死受體鼠，取股骨制備骨髓細胞懸液，計算單只股骨骨髓有核細胞(bone marrow nucleated cells, BMNCs)總數(shù)。收集兩組受體小鼠的BMNCs各1×10個，PBS洗滌2次，70%冷乙醇，4 ℃固定過夜。測定前遺棄固定液，加入碘化丙啶和RNA酶工作液，4 ℃染色處理30 min，300目濾網(wǎng)過濾后上流式細胞儀，經(jīng)計算機數(shù)據(jù)處理分析得出細胞周期的各時相比例。

1.8 受體鼠骨髓基質(zhì)細胞增殖能力檢測與成纖維細胞集落(CFU-F)計數(shù)

提取受體小鼠骨髓單個核細胞，DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，觀察細胞貼壁生長情況，取對數(shù)生長期的細胞，在培養(yǎng)體系中加入EDU(100 μL，50 μmol/L)作用24 h，按照EDU試劑盒說明書操作，每孔隨機選擇3個視野，在熒光顯微鏡下觀察陽性信號，并計算EDU染色陽性細胞百分率(陽性細胞總數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

在37 ℃，含5% CO條件下在6孔板中培養(yǎng)CFU-F，每隔4 d更換1次細胞培養(yǎng)基，共培養(yǎng)10 d，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入甲醇溶液固定細胞10 min，每孔加入結(jié)晶紫染液，用蒸餾水洗滌各孔，37 ℃烘干進行CFU-F計數(shù)和拍照。

1.9 血清和骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中造血生長因子測定

取受體小鼠眼眶血，制備血清備用。按1.8方法培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，收集培養(yǎng)10 d的上清液，雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒檢測血清與細胞上清液中造血生長因子含量。①建立標準曲線；②每孔各加入待測樣品10 μL，樣本稀釋液40 μL；③加HRP標記的抗體100 μL，將反應板置37 ℃ 60 min；④洗滌反應板4～6次,在濾紙上印干；⑤每孔加入底物工作液各50 μL，置37 ℃暗處反應15 min；⑥在450 nm處測光密度值；⑦根據(jù)標準曲線計算IL-3、GM-CSF、SCF的含量。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 ASP對受體小鼠體質(zhì)量變化的影響

對照組小鼠7 d內(nèi)全部死亡。輻射后，BMT組與TASP組受體小鼠體質(zhì)量均下降，在骨髓移植5～6 d后體質(zhì)量逐步回升。TASP組小鼠體質(zhì)量恢復明顯較快(

P

<0.05)，見圖1。且小鼠的精神狀態(tài)、進食和活動明顯好于BMT組小鼠。

a：P<0.05，與BMT組比較

2.2 受體小鼠骨髓細胞與脾集落細胞檢測到Y(jié)染色體決定基因

移植雄性供體骨髓細胞后，在受體小鼠骨髓細胞與脾集落細胞檢出Y染色體Sry基因片段，其片段長度為312 bp，提示供體小鼠骨髓細胞已經(jīng)成功移植入雌性受體小鼠骨髓和脾臟(圖2)。

A：受體小鼠骨髓細胞Sry基因的檢測 1：DNA標準；2～3：雌性小鼠骨髓細胞PCR產(chǎn)物；4～5：雄性小鼠骨髓細胞 PCR產(chǎn)物; 6：移植后BMT組受體雌性小鼠骨髓細胞 PCR產(chǎn)物; 7: 移植后TASP組受體雌性小鼠骨髓細胞 PCR產(chǎn)物；B：受體小鼠脾集落中Y染色體的檢測 1：DNA標準；2:BMT組受體鼠脾集落Sry基因檢測; 3: TASP組受體鼠脾集落Sry基因檢測

2.3 ASP對受體小鼠血常規(guī)指標的影響

TASP組小鼠的RBC、WBC、HGB數(shù)量均明顯高于BMT組小鼠(

P

<0.05)，見表1。提示ASP能促進供體骨髓細胞對受體小鼠的造血功能重建。

表1 ASP對移植供體骨髓細胞后受體小鼠血常規(guī)指標的影響

2.4 ASP對受體小鼠股骨有核細胞數(shù)和骨髓細胞周期分布的影響

結(jié)果表明，BMT組單只股骨有核細胞數(shù)為(7.63±0.76)×10，而TASP組小鼠單只股骨有核細胞數(shù)為(8.87±0.91)×10。TASP組小鼠骨髓細胞G/G期細胞比例下降，而S期和G/M期細胞比例明顯增高(

P

<0.05)，見表2。

A：BMT組的細胞數(shù)；B：TASP組的細胞數(shù)

表2 ASP對受體小鼠骨髓細胞周期分布的影響

2.5 ASP對受體小鼠骨髓基質(zhì)細胞增殖能力和CFU-F形成數(shù)量的影響

EDU細胞增殖檢測實驗表明，TASP組小鼠骨髓基質(zhì)細胞的增殖能力明顯高于BMT組小鼠(

P

<0.05),見圖4。TASP組受體小鼠的骨髓基質(zhì)細胞貼壁率更高，且小鼠CFU-F形成數(shù)量明顯高于BMT組小鼠(

P

<0.05),見圖5。提示ASP可以促進受體小鼠骨髓造血基質(zhì)細胞的增殖。

A：骨髓基質(zhì)細胞EDU實驗(熒光倒置顯微鏡)；B：EDU染色陽性細胞百分率 a:P<0.05,與BMT組比較

A：骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長情況(×100)；B：CFU-F結(jié)晶紫染色實驗 ↑：示CFU-F；C: CFU-F形成數(shù)量 a: P<0.05,與BMT組比較

2.6 ASP對受體小鼠造血生長因子生成的影響

結(jié)果表明，TASP組小鼠血清和骨髓基質(zhì)細胞上清液中GM-CSF、IL-3、SCF水平明顯高于BMT組(

P

<0.05),見圖6。

A: 受體小鼠骨髓基質(zhì)細胞上清液中GM-CSF的水平；B：受體小鼠骨髓基質(zhì)細胞上清液中SCF的水平；C：受體小鼠血清中造血因子水平；a:P<0.05,與BMT組比較

3 討論

既往研究證明，當歸多糖是當歸中重要的抗衰老成分，能促進造血干細胞增殖和分化，延緩造血干細胞衰老，并能促進移植骨髓細胞重建受體小鼠的造血功能，但其機制尚不清楚。本研究構(gòu)建輻射所致小鼠骨髓衰竭模型，通過移植供體骨髓單個有核細胞，研究ASP促進受體小鼠造血功能機制。

移植供體造血干細胞或全骨髓是治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、造血與免疫功能衰竭和腫瘤輔助治療等的有效手段。本研究將雄性小鼠骨髓造血細胞移植給受致死劑量輻射的雌性受體小鼠，探討供體造血細胞對致死劑量輻射受體小鼠的造血重建功能。結(jié)果表明，8.0 Gy的X射線一次性輻射為C57BL/6J小鼠的致死劑量，如果不移植供體骨髓細胞，小鼠在幾天內(nèi)全部死亡，與相關研究結(jié)果一致。移植骨髓細胞后，在受體小鼠骨髓細胞與脾集落細胞中檢測出供體Y染色體Sry基因片段。本實驗證實雄性供體小鼠骨髓成功移植入雌性受體小鼠骨髓和脾臟，為研究來自供體骨髓造血細胞在受體小鼠體內(nèi)的造血重建工作奠定了理論與技術(shù)基礎。由于PCR的敏感性及未設立目標序列的量級對照曲線，對植入細胞定量還有待進一步研究。

有研究報道，給受致死劑量輻射的小鼠移植同種骨髓細胞，第9天左右可在受體小鼠脾表面觀察到肉眼可見的結(jié)節(jié)，即脾集落生成單位(CFU-S)，受體小鼠造血功能得以重建。造血功能重建成功的重要標志是外周血指標的快速恢復。本課題組檢測了骨髓移植后第9天受體小鼠外周血指標，結(jié)果表明，TASP組小鼠外周血的RBC、WBC、HGB數(shù)量恢復速度顯著快于BMT組，且小鼠精神狀態(tài)、活動能力與體質(zhì)量增加也明顯好于BMT組小鼠，提示ASP能促進供體骨髓細胞對受體小鼠的造血重建進程。

骨髓是機體的終身造血器官，骨髓造血功能是評價造血重建的關鍵指標。骨髓細胞總數(shù)和細胞周期分布是反映骨髓細胞增殖活性的具體參數(shù)。本研究表明，BMT組和TASP組小鼠的骨髓有核細胞數(shù)量均逐漸回升，但是骨髓移植后注射ASP可使小鼠BMNC數(shù)量回升速度明顯加快，且股骨有核細胞的G/G期細胞比例下降，而S期和G/M期細胞比例明顯增高。這提示ASP可促進移植骨髓細胞增殖，加快受體小鼠的造血重建步伐。

造血誘導微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment, HIM)對造血干細胞增殖分化起著重要調(diào)控作用。HIM的核心成分是造血基質(zhì)細胞，它為造血細胞增殖與分化提供生物支架，還可通過分泌造血生長因子調(diào)控血細胞的發(fā)生。研究報道，造血微環(huán)境對造血重建功能起著重要的作用，ASP可通過直接或間接改善造血微環(huán)境來調(diào)控血細胞發(fā)生。本研究結(jié)果表明，ASP可提高骨髓基質(zhì)細胞貼壁和增殖能力，且可提高CFU-F集落生成數(shù)量，提示ASP可能通過改善受體HIM環(huán)境，從而促進供體骨髓細胞加快對受體小鼠造血重建作用。

造血生長因子對造血細胞增殖分化起著重要的調(diào)控作用，參與調(diào)控造血細胞發(fā)生的正向因子主要包括GM-CSF、SCF、EPO、IL-3等。為了進一步闡釋ASP促進造血重建功能的機制，本研究檢測了受體小鼠血清與骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液的造血因子的水平。結(jié)果表明，ASP能顯著提高血清中GM-CSF和IL-3水平，也能提高骨髓基質(zhì)細胞上清液中GM-CSF和SCF水平。提示ASP促進造血重建機制可能與通過刺激骨髓基質(zhì)細胞分泌GM-CSF、IL-3和SCF有密切的關系。但ASP對造血生長細胞因子受體及其與受體結(jié)合后啟動的信號傳導還需要進一步研究。

綜上所述，本研究探討了當歸多糖對骨髓細胞移植后受體小鼠造血功能重建的機制。結(jié)果提示，ASP提高受體小鼠造血重建功能的初步機制與改善造血微環(huán)境和促進造血相關因子的產(chǎn)生有關，其具體機制還有待進一步的研究。但本實驗沒有設計與臨床常用藥進行比較，因此ASP在骨髓細胞移植中的機制還有待進一步研究。