譚 君，張 弛，董 嚴(yán)，梁后杰

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院腫瘤科

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是目前癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，并且持續(xù)處于高發(fā)生率和高死亡率。目前對(duì)于肝癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、生物靶向治療等；對(duì)于晚期肝癌患者，目前缺乏有效的治療手段。索拉非尼(sorafenib, Sor)是一種小分子藥物，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成，并在多種腫瘤模型中增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率。它通過抑制絲氨酸-蘇氨酸激酶(Raf-1、B-Raf)以及血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factors receptors，VEGFRs)和血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor β，PDGFR-β)的受體酪氨酸激酶活性發(fā)揮作用，是治療晚期肝癌的一線藥物。膽紅素(bilirubin，Bil)是血液中衰老紅細(xì)胞分解代謝的產(chǎn)物，在健康的肝細(xì)胞中膽紅素可與葡萄糖醛酸結(jié)合并排泄到腸道。在肝細(xì)胞損傷的情況下，膽紅素可以釋放到血液中，與血清白蛋白緊密結(jié)合，因此，血膽紅素水平在臨床上也被用作肝功能的重要預(yù)測指標(biāo)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，膽紅素能夠結(jié)合到過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARα)上，發(fā)揮代謝功能。PPARα通過上調(diào)在過氧化物酶體和線粒體中的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而促進(jìn)攝取、利用、代謝脂肪酸。

研究表明，升高的膽紅素是索拉非尼治療肝癌預(yù)后的一個(gè)不良預(yù)測因子。但膽紅素是否會(huì)影響索拉非尼對(duì)肝癌的治療效果目前尚不清楚。本研究以人肝癌細(xì)胞株(Huh7細(xì)胞株)為研究對(duì)象，觀察膽紅素對(duì)索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，并探討膽紅素發(fā)揮作用與PPARα/CPT1A信號(hào)途徑的關(guān)系，為肝癌的防治提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

胎牛血清購自ABW公司；結(jié)晶紫染色液、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS PAGE蛋白上樣緩沖液均購自碧云天公司；二甲基亞砜、CCK-8試劑盒購自索萊寶公司；兔抗人CPT1A、PPARα、β-actin抗體購自三鷹抗體公司；山羊抗兔二抗及山羊抗鼠抗體購自Affinity公司；PCR引物購自上海生工；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green購自Vazyme公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自貝博公司；膽紅素、索拉非尼、乙莫克舍(etomoxir，Eto)、PEG400均購自上海陶術(shù)生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液(×100)、0.25% 胰蛋白酶均購自HyClone公司；PVDF膜購自賽默飛公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素培養(yǎng)基的DMEM培養(yǎng)基放在37 ℃、含5%CO的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將Huh7細(xì)胞以3 000/孔接種在96孔板上。24 h后，Sor(0、2、4、8、16、32 μmol/L)、Bil(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)分別處理Huh7細(xì)胞24、48、72 h；隨后將兩者一起共同培養(yǎng)Huh7細(xì)胞(0、2、4、8、16、32 μmol/L的Sor分別加20 μmol/L Bil)孵育48 h，用PBS洗2遍，每孔加入10 μL CCK-8染料溶液與90 μL DMEM混合液，在37 ℃下培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處的光密度值[

D

(450)]。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下。細(xì)胞存活率=[

D

(450)-

D

(450)]/[

D

(450)-

D

(450)]×100%

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

Huh7細(xì)胞按1 500/孔接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置Bil(0、10和20 μmol/L)和Bil(0、10和20 μmol/L)+4 μmol/L Sor培養(yǎng)；每隔3 d換液1次，維持藥物濃度，直到出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落后，用甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色5 min后拍照。

1.5 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)

Huh7細(xì)胞按約5×10/孔接種于96孔板中，貼壁24 h后用無血清的DMEM培養(yǎng)16 h，設(shè)置4組，分別為：Con組、Bil組(20 μmol/L)、Sor組(4 μmol/L)、Bil(20 μmol/L)+Sor(4 μmol/L)組，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：用PBS洗2遍，胰酶消化細(xì)胞后離心，用冷PBS洗2遍后，重新加入500 μL冷PBS重懸細(xì)胞，隨后緩慢滴加1 500 μL預(yù)冷的無水乙醇，達(dá)到無水乙醇的終濃度為75%，4 ℃過夜。離心沉淀細(xì)胞后，再用冷PBS洗1次；500 μL冷PBS 重懸細(xì)胞后加入20 μL Rnase A 37 ℃水浴30 min，400目網(wǎng)篩過濾。加入400 μL PI染液，輕輕混勻后4 ℃避光孵育1 h；上機(jī)，最大激發(fā)波長為488 nm。

1.6 裸鼠異種移植瘤模型

雄性BALB/c裸鼠16只(5～6周齡，體質(zhì)量20～22 g)，收集培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞并重懸于PBS中，然后皮下注射100 μL(含2×10個(gè)Huh7細(xì)胞)細(xì)胞懸液于裸鼠的右腹股溝。植瘤10 d后，按S型抽樣方法，分為4組：Con組、Bil組(25 mg·kg·d)、Sor組(15 mg·kg·d)，Bil(25 mg·kg·d)+Sor(15 mg·kg·d)聯(lián)用組，每組4只，給藥方式均采用腹腔注射。監(jiān)測動(dòng)物活動(dòng)及一般狀況，每3天測量1次裸鼠體質(zhì)量和腫瘤大小，并根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=(a×b)/2(a為長邊，b為短邊)。藥物干預(yù)24 d后，處死小鼠，取腫瘤稱量。

1.7 Western blot檢測

將藥物處理過的細(xì)胞用冷PBS洗2遍，加入適量的RIPA裂解液在冰上分別提取Con組、Bil組、Sor組、Bil+Sor組的細(xì)胞。用碧云天BCA濃度試劑盒檢測蛋白濃度后，每孔按照25 μg、10 μL體系進(jìn)行上樣；用80 V 電泳20 min，隨后用120 V電壓電泳，當(dāng)?shù)鞍咨蠘泳彌_液到玻璃板底即停止。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。PVDF孔徑為0.45 μm，甲醇激發(fā)，然后恒流250 mA、90 min在冰水混合物中轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢，用5%BSA在搖床上室溫封閉2 h。CPT1A(1∶1 000)、PPARα(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)按比例配置后4 ℃搖床過夜，PBST洗3次，每次5 min，第2天用Affinity二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次5 min，用碧云天高敏ECL顯影液在機(jī)器上曝光。

1.8 熒光定量PCR檢測

將藥物處理過的細(xì)胞用PBS洗2遍，6孔板每孔加入1 mL TRIzol,隨后用TRIzol法提取總RNA，用分光光度計(jì)測量RNA濃度，隨后按照諾維贊反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄完畢進(jìn)行熒光定量PCR。CPT1A上游:5′-GAGTGCCAGGAGGTCATAGATGC-3′，下游: 5′-CAGTCTCTGTCCTCCCTTCTCG-3′；ACOX1上游：5′-CTTGCTTCACCAGGCAACTG-3′，下游：5′-CTGTCTGGGCATAAGTGCCA-3′；PPARα上游：5′-GATGCGCTGACAGATGGAGA-3′，下游：5′-TAGAGACGGCTCTTCTGCCT-3′；GAPDH上游：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，下游：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Bil對(duì)Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長活力的影響

首先，以不同濃度Sor(0、2、4、8、16、32 μmol/L)處理Huh7細(xì)胞株24、48、72 h后，CCK-8法結(jié)果顯示：隨著Sor作用時(shí)間和濃度的增加，細(xì)胞活力下降，呈明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系(

P

<0.05，圖1A)。其次，以不同濃度Bil(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)處理Huh7細(xì)胞株24、48、72 h后，CCK-8法結(jié)果顯示：隨著Bil作用時(shí)間和濃度的增加，細(xì)胞活力無明顯變化(圖1B)。隨后，以不同濃度Sor(0、2、4、8、16、32 μmol/L)與Bil(20 μmol/L)共同處理Huh7細(xì)胞48 h，CCK-8法結(jié)果顯示：與單用Sor相比，Bil+Sor細(xì)胞活力增加(

P

<0.05，圖1C)。

A：不同Sor濃度對(duì)Huh7細(xì)胞活力的影響 a：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)前一濃度比較；b：P<0.05，與同濃度24 h比較；c：P<0.05，與同濃度48 h比較；B：不同Bil濃度對(duì)Huh7細(xì)胞活力的影響；C：不同濃度Sor濃度聯(lián)合20 μmol/L Bil對(duì)Huh7細(xì)胞活力的影響 a:P<0.05，b：P<0.01，與Sor組比較

2.2 Bil對(duì)Sor誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制的影響

以不同濃度Bil(0、10、20 μmol/L)、Bil(0、10、20 μmol/L)聯(lián)合4 μmol/L Sor處理Huh7細(xì)胞14 d，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組相比，單用Sor組的細(xì)胞克隆數(shù)減少(

P

<0.01，圖2)。與單用Sor組相比，Bil+Sor組細(xì)胞克隆數(shù)增多(

P

<0.05，圖2)。

1：Con組；2：10 μmol/L Bil組；3：20 μmol/L Bil組；4：4 μmol/L Sor組；5：10 μmol/L Bil+Sor 4 μmol/L組；6：20 μmol/LBil+Sor 4 μmol/L組 a: P<0.01,與Con組比較；b: P<0.05，與Sor組比較

2.3 Bil對(duì)Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞周期的影響

為了探究Bil減弱 Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長抑制作用與細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)性，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，各組細(xì)胞處理48 h后，與Sor組相比，Bil+Sor組S期細(xì)胞數(shù)目減少(

P

<0.05，圖3)。

2.4 Bil對(duì)Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞體內(nèi)生長抑制作用的影響

為了進(jìn)一步研究Bil是否能在體內(nèi)消除Sor的抗癌作用，以Huh7細(xì)胞(2×10)皮下注射到5～6周無胸腺裸鼠體內(nèi)，Sor(15 mg·kg·d)、Bil(25 mg·kg·d)或Bil(25 mg·kg·d)聯(lián)合Sor(15 mg·kg·d)處理。結(jié)果顯示，Sor組的腫瘤體積和質(zhì)量、腫瘤生長速率均低于Con組(

P

<0.01，圖4)，并且這種抗腫瘤作用在體內(nèi)被Bil治療逆轉(zhuǎn)(

P

<0.05，圖4)。

A：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)；B：腫瘤生長曲線；C：腫瘤質(zhì)量 a: P<0.01，與Con組比較；b: P<0.05，與Sor組比較

2.5 Bil損害Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的生長抑制作用與激活PPARα/CPT1A有關(guān)

為了驗(yàn)證Bil削弱Sor誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的生長抑制作用與脂肪酸氧化的相關(guān)性。通過檢測是否共處理Bil情況下，Sor處理的Huh7細(xì)胞中脂肪酸氧化關(guān)鍵酶PPARα、CPT1A表達(dá)情況。Western blot檢測結(jié)果顯示，與單用Sor組相比，Bil+Sor組PPARα、CPT1A的表達(dá)量增加(

P

<0.05,圖5A、B)。熒光定量PCR結(jié)果也顯示，與Sor組相比，Bil+Sor組Huh7細(xì)胞的PPARα、CPT1A、ACOX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(

P

<0.01，圖5C)。

A、B：Western blot檢測蛋白表達(dá)及半定量分析 1：Sor(4 μmol/L)組；2：Bil(10 μmol/L)+Sor(4 μmol/L)組；3：Bil(20 μmol/L)+Sor(4 μmol/L)組 a: P<0.05，與Sor組(4 μmol/L)比較；C：熒光定量PCR檢測脂肪酸氧化相關(guān)關(guān)鍵基因CPT1A、PPARα、ACOX1的mRNA表達(dá) b: P<0.01，與Sor組比較

2.6 PPARα/CPT1A參與膽紅素減弱索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的生長抑制作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Bil降低Huh7細(xì)胞對(duì)Sor的敏感性是否與PPARα/CPT1A有關(guān)。CPT1A抑制劑Eto(75 μmol/L)與Sor(4 μmol/L)和Bil(10 μmol/L)共處理后，再次檢測細(xì)胞增殖及克隆形成情況。結(jié)果顯示：與Con組相比，Sor組細(xì)胞活力和克隆形成率均明顯降低(

P

<0.01，圖6)；而Bil+Sor組細(xì)胞活力和克隆形成率較Sor組明顯升高(

P

<0.01，圖6)；而Bil+Sor+Eto組細(xì)胞活力和克隆形成率較Bil+Sor組明顯降低(

P

<0.05，圖6)。

A：CCK-8檢測加入CPT1A抑制劑后細(xì)胞活力；B：相對(duì)集落形成率 1：Con組；2：Eto組；3：Sor組；4：Bil+Sor組；5：Bil+Sor+Eto組 a：P<0.01，與Con組比較；b：P<0.01，與Sor組比較；c：P<0.05，與Bil+Sor組比較；C:加入CPT1A抑制劑后細(xì)胞克隆形成能力檢測

3 討論

本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討膽紅素在索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖抑制中的作用。結(jié)果表明，膽紅素減弱Huh7細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)索拉非尼的敏感性。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明PPARα/CPT1A信號(hào)通路可能參與了膽紅素減弱索拉非尼誘導(dǎo)的生長抑制作用；并且在膽紅素存在下，使用CPT1A抑制劑增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)提示在膽紅素升高的患者中，聯(lián)合使用CPT1A抑制劑和索拉非尼對(duì)HCC患者可能具有一定的治療價(jià)值。

索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，已被臨床批準(zhǔn)用于治療晚期HCC患者。然而,與索拉非尼治療相關(guān)的生存益處約3個(gè)月。而進(jìn)展期肝癌在一般情況下都會(huì)有肝功能障礙，伴隨膽紅素升高。本研究發(fā)現(xiàn)，使用不同濃度索拉非尼作用肝癌細(xì)胞時(shí)，加用膽紅素處理，細(xì)胞活力增加10%～35%。這表明在膽紅素存在條件下，HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性減弱。

能量代謝的重新編程已經(jīng)被認(rèn)為是癌癥的一個(gè)重要標(biāo)志。癌細(xì)胞將有氧糖酵解作為主要的能量來源，也可以利用其他物質(zhì)如谷氨酰胺、脂肪酸等提供三磷酸腺苷(ATP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和癌細(xì)胞中其他重要大分子合成代謝物質(zhì)。在β-連環(huán)蛋白突變的肝癌、膀胱癌以及白血病的發(fā)生過程中觀察到脂肪酸吸收和脂肪酸氧化(FAO)增強(qiáng)，并且在膀胱癌和急性白血病中使用CPT1A抑制劑能夠抑制其增殖。膽紅素由體內(nèi)衰老紅細(xì)胞產(chǎn)生，很長一段時(shí)間被認(rèn)為是肝臟疾病的潛在危險(xiǎn)信號(hào)。最近的研究顯示膽紅素也可以作為過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)的激動(dòng)劑。PPARα是一種核受體，通過配體激活與數(shù)千個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，以增加脂肪燃燒，減少脂肪儲(chǔ)存。PPARα通過調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化對(duì)關(guān)鍵靶基因CPT1A發(fā)揮作用。乙莫克舍是CPT1A的抑制劑，已經(jīng)用于心臟病和糖尿病的治療，可以不可逆的抑制CPT1A的表達(dá)。本研究通過Western blot和RT-qPCR探討了膽紅素減弱索拉非尼對(duì)HCC生長抑制的分子機(jī)制，膽紅素可以增加索拉非尼治療下PPARα、CPT1A的表達(dá)，相反，加入CPT1A抑制劑后，CCK-8實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：乙莫克舍阻斷了膽紅素與索拉非尼潛在的分子機(jī)制方面的聯(lián)系，使HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性增加。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，膽紅素作為一個(gè)代謝調(diào)控物，通過促進(jìn)脂肪酸氧化，從而減弱索拉非尼對(duì)肝癌的療效，同時(shí)發(fā)現(xiàn)靶向脂肪酸氧化通路PPARα/CPT1A可以提高索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。但還需要更多的應(yīng)用及毒理學(xué)研究來闡明聯(lián)用效果、機(jī)制及毒副作用，將有助于在膽紅素升高情況下增加晚期肝癌患者對(duì)索拉非尼的敏感性提供新的證據(jù)。