金翠柳 ,柴 鈺 ,凌 望 ,吳美平 ,金素安

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071；2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203)

腫瘤心臟病是臨床影響腫瘤患者生存率的一類重要疾病,尤其是放療或化療藥物誘發(fā)的心臟毒性最為常見,其中化療藥物誘發(fā)心臟毒性在抗癌治療中發(fā)病率高,常常影響腫瘤患者的預(yù)后,是妨礙腫瘤幸存者生命健康的一大挑戰(zhàn)[1-4]。目前針對(duì)化療藥物誘發(fā)的心臟毒性尚無明確的治療措施,建立可靠的心臟毒性模型是進(jìn)行藥物研究的前提。構(gòu)建心臟毒性模型多采用放療或化療藥物進(jìn)行干預(yù),化療藥物干預(yù)常以多柔比星藥物腹腔注射構(gòu)建心臟毒性模型較為常見[5-6]。且采用藥物注射操作技術(shù)簡便、易于大量重復(fù),是目前探索腫瘤心臟病治療方法的合適動(dòng)物模型。

構(gòu)建多柔比星誘導(dǎo)小鼠心臟毒性模型是心血管基礎(chǔ)研究常用的動(dòng)物模型之一[7-8],也是探索腫瘤心臟病的病理發(fā)生、發(fā)展以及治療方法的前提,然而通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),構(gòu)建心臟毒性模型采用的多柔比星藥物濃度差異較大,給藥策略和評(píng)價(jià)指標(biāo)不規(guī)范,給藥濃度從3～10 mg/kg 均有涉及,其中有采用多柔比星給藥濃度3 mg/kg,隔天給藥1 次,給藥2 周來構(gòu)建該模型,以小鼠心超指標(biāo):左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)下降為建模成功指標(biāo)[9]。也有采用4 mg/kg 多柔比星藥物濃度連續(xù)注射4 周,以血清中肌鈣蛋白T(cTnT)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶-同功酶(CK-MB)等指標(biāo)上升視為建模成功指標(biāo)[10]。更甚者提出在第1、3、5 天給予多柔比星10 mg/kg 腹腔注射,1 周后也可檢測(cè)到小鼠心功能下降,心肌細(xì)胞凋亡[11],綜合上述發(fā)現(xiàn)該模型對(duì)于造模用藥劑量、時(shí)間差異極大,且目前國內(nèi)外研究對(duì)多柔比星構(gòu)建心臟毒性模型以何種濃度誘導(dǎo),以及誘導(dǎo)的時(shí)間長短均無定論[12-14]。本研究通過參考臨床多柔比星化療方案[15-16],并結(jié)合多柔比星藥代動(dòng)力學(xué)特征,多柔比星血漿濃度呈多相衰減,終末相半衰期為50 h[17],探討在同等的造模時(shí)長(4 周)、給藥周期(每3 d 1 次)下系統(tǒng)地探討不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心臟損傷、心臟組織結(jié)構(gòu)變化的影響,以期構(gòu)建出成模率高且死亡率低的多柔比星慢性心臟損傷模型,為后續(xù)開展多柔比星相關(guān)實(shí)驗(yàn)的廣大研究者提供造模參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)別實(shí)驗(yàn)雄性小鼠C57BL/6J,36 只,20～22 g,6～8 周齡,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005],在上海同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(滬)2018-0034]SPF 屏障環(huán)境(室溫20℃～25℃,濕度60%～70%)下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海同濟(jì)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(TJHBLAC-2019-057)。實(shí)驗(yàn)過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑

鹽酸多柔比星(Med Chem Express,美國；批號(hào):HY-15142)；活化后的半胱氨酸蛋白3(Cleavedcaspase-3)(CST,美國；批號(hào):9664S)；促凋亡蛋白(Bax)(CST,美國；批號(hào):ab182734)；抑凋亡蛋白(Bcl2)(CST,美國；批號(hào):ab182858)；抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(CST,美國；批號(hào):5174S)；山羊抗兔 IgG (H+L) (Yeasen,中國；批號(hào):33101ES60)；天狼猩紅染色試劑盒(索萊寶科技有限公司,中國；批號(hào):S8060)；麥胚凝集素染色試劑盒(Thermo,美國；批號(hào):L2785)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模

8 周齡SPF 級(jí)別雄性C57BL/6J 小鼠36 只,將其隨機(jī)分為NS 組、3 mg/kg 多柔比星劑量組、4 mg/kg 多柔比星劑量組、5 mg/kg 多柔比星劑量組、6 mg/kg 多柔比星劑量組、7 mg/kg 多柔比星劑量組,每組各6 只。實(shí)驗(yàn)小鼠根據(jù)分組腹腔注射不同濃度多柔比星和生理鹽水,每3 d 1 次,共10 次。30 d后,處死小鼠,取出心臟,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

(1)HE 染色

參照文獻(xiàn)[18],常規(guī)脫蠟至水后,按說明書使用伊紅-蘇木素染料進(jìn)行染色,心臟組織常規(guī)脫水透明后進(jìn)行封片處理,在顯微鏡下觀察組織顯色效果并采集圖像。

(2)天狼猩紅染色

參照文獻(xiàn)[19],常規(guī)脫蠟至水后,準(zhǔn)備濕盒,用免疫組化筆在組織周圍畫圈,按說明書使用天狼猩紅染料進(jìn)行染色,心臟組織常規(guī)脫水透明后進(jìn)行封片處理,在顯微鏡下觀察組織顯色效果并采集圖像。

(3)麥胚凝集素染色

參照文獻(xiàn)[20],烤片,脫蠟至水,使用微波爐將組織用檸檬酸鈉修復(fù)液進(jìn)行抗原熱修復(fù),甘氨酸室溫孵育20 min,用PBS 洗1 次。準(zhǔn)備濕盒,用免疫組化筆在組織周圍畫圈,按說明書要求進(jìn)行麥胚凝集素染色,染色完成后使用熒光顯微鏡觀察組織顯色效果并采集圖像,后續(xù)使用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞橫截面積。

(4)蛋白免疫印跡(Western blot)

稱取并研磨相同重量的心臟組織,裂解并提取蛋白,測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,后續(xù)加入一抗GAPDH、Bax、Bcl2、Cleavedcaspase3 和相應(yīng)二抗孵育,Bio-Rad 凝膠成像分析儀曝光,Image J 統(tǒng)計(jì)各組灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),其中多組間比較用One-Way ANOVA 分析法,多組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn),兩組間均值差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠一般情況及生存率的影響

與NS 組相比,6 mg/kg 多柔比星模型組小鼠存活5 只,7 mg/kg 多柔比星模型組小鼠存活1 只,其余濃度模型組小鼠均存活,提示小鼠生存率隨著多柔比星的濃度增加而同步下降,見圖1A。取材后對(duì)各組小鼠心臟拍照觀察,發(fā)現(xiàn)隨著多柔比星濃度的上升,小鼠心臟呈劑量依賴性的縮小,見圖1B。同時(shí)對(duì)小鼠心臟中段橫截面進(jìn)行HE 染色,從圖1C 可見,與生理鹽水組相比,多柔比星組小鼠心臟整體縮小,心室內(nèi)徑擴(kuò)大,與肉眼觀察相符。后期對(duì)小鼠的體重、心臟重量、心重比及其心脛比進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)與NS 組相比,多柔比星組小鼠的體重、心臟重量、心脛比均下降,且隨著多柔比星濃度的增加而同步下降(P＜0.05),但在小鼠心重比參數(shù)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),可能與多柔比星注射后體重同步下降有關(guān),見圖1D～1G。

圖1 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠一般情況及生存率的影響(n=6)Note.A,Mouse survival curve.B,Pictures of representative hearts of mice in each group.C,Schematic diagram of HE staining of mice in each group.D,Body weight statistics of mice in each group.E,Heart weight statistics of mice in each group.F,Statistics of the ratio of heart to body weight in each group.G,Statistics of the tibia heart weight ratio of mice in each group.Compared with normal saline group,***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05,nsP ＞0.05.Figure 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on general condition and survival rate of mice

2.2 不同濃度多柔比星對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

心肌細(xì)胞凋亡是多柔比星誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的方式之一,同時(shí)也是多柔比星誘導(dǎo)慢性心臟損傷的病理表現(xiàn)之一[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NS 組相比,多柔比星藥物濃度為3 mg/kg 時(shí)心臟組織中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達(dá)量未見明顯增高,Bax/Bcl2 比值也無明顯上升(P＞0.05)。而當(dāng)藥物濃度達(dá)到4 mg/kg 后,與NS 組相比,Bax/Bcl2 比值明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Cleaved-caspase3 的表達(dá)量增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)給藥濃度為5～6 mg/kg 時(shí),Bax/Bcl2 比值與Cleaved-caspase3 表達(dá)均明顯增加,見圖2A～2F。

圖2 不同濃度多柔比星對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響(n=6)Note.A～D,Representative Western blot of Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 and GAPDH protein expression.E,A statistical chart of Cleaved-caspase3 relative expression levels.F,Statistical diagram of the ratio of Bax protein relative level expression to Bcl2 protein relative level expression.Compared with normal saline group,***P＜0.001,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 2 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial apoptosis

2.3 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心肌纖維化的影響

通過對(duì)心臟組織進(jìn)行天狼猩紅染色,結(jié)果顯示:3 mg/kg 多柔比星組與NS 組相比,膠原纖維沉積較少,心肌纖維化程度不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),見圖3A、3B。當(dāng)多柔比星劑量達(dá)到4 mg/kg以上時(shí),與NS 組相比,心臟組織中可見明顯的膠原纖維沉積,心肌纖維化程度加重,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),圖3A、3B。橫向比較不同濃度多柔比星給藥組組間差異發(fā)現(xiàn),小鼠心臟心肌纖維化程度并未隨著多柔比星給藥濃度的增加而上升,可能是小鼠心臟纖維化程度不具備明顯的劑量依賴性特征,或者是給藥后觀察時(shí)長不夠?qū)е隆?/p>

圖3 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心肌纖維化的影響(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes Sirius scarlet dye.B,Statistical map of the proportion of cardiac fibrosis in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 3 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial fibrosis in mice

2.4 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心肌細(xì)胞萎縮的影響

前期通過對(duì)小鼠的一般情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)多柔比星呈劑量依賴性降低小鼠的心臟重量,說明多柔比星可能導(dǎo)致心臟萎縮。通過對(duì)小鼠心臟組織進(jìn)行WGA 染色發(fā)現(xiàn),3 mg/kg 濃度造模組與NS 組相比,小鼠單個(gè)心肌細(xì)胞大小未見明顯縮小,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而當(dāng)多柔比星濃度達(dá)到4 mg/kg 以上時(shí),小鼠單個(gè)心肌細(xì)胞可見明顯縮小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖4。

圖4 不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心肌細(xì)胞萎縮的影響(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes wheat germ lectin staining.B,Statistical diagram of the effect of doxorubicin at different concentrations on the crosssectional area of myocardial cells in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 4 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial cell atrophy in mice

3 討論

多柔比星為臨床上治療實(shí)體腫瘤的經(jīng)典藥物,臨床研究發(fā)現(xiàn)長期使用多柔比星會(huì)增加腫瘤病人患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),以心律失常、左室功能障礙、充血性心力衰竭等為主,其原因多數(shù)認(rèn)為是多柔比星隨劑量及時(shí)間累積對(duì)心肌細(xì)胞損傷導(dǎo)致的凋亡、萎縮以及對(duì)心肌纖維化的促進(jìn)作用共同導(dǎo)致的心室重構(gòu)[3],在基礎(chǔ)病理生理學(xué)以及藥理學(xué)研究中,小鼠腹腔注射多柔比星是常用的體內(nèi)模型[5],可以很好地模擬臨床患者化療后誘發(fā)的心臟毒性。

多柔比星除了急性大劑量心臟損傷外,小劑量隨時(shí)間和劑量蓄積是目前模型使用非常多的造模方式,但因?yàn)閲鴥?nèi)外文獻(xiàn)中對(duì)多柔比星誘導(dǎo)心臟模型的給藥濃度與給藥時(shí)長不同,且未有統(tǒng)一定論[13,22],前期課題組研究發(fā)現(xiàn)多柔比星損傷劑量與致死量窗口非常窄,導(dǎo)致模型難以重復(fù),本研究觀察不同劑量多柔比星在一定時(shí)間(4 周)內(nèi)蓄積后體重,心臟重量,生存率及病理學(xué)指標(biāo)如凋亡、萎縮、纖維化等指標(biāo),尋找比較合適的造模劑量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,隨著多柔比星藥物濃度增加,小鼠體重和心臟重量下降,生存率下降,但給藥濃度低于4 mg/kg 則指標(biāo)惡化不明顯,高于6 mg/kg 后小鼠大量死亡,提示4～6 mg/kg 的給藥濃度是較合適的造模方法。

多柔比星導(dǎo)致心室重構(gòu)的主流觀點(diǎn)是引起心臟萎縮[23-24],在本研究中,我們使用了不同劑量的多柔比星對(duì)小鼠心肌質(zhì)量的影響進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)多柔比星給藥濃度達(dá)4 mg/kg,且體內(nèi)藥物累積劑量達(dá)40 mg/kg 時(shí),小鼠的心臟指數(shù)顯著下降,與目前的臨床給藥方案范圍接近,且與臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的當(dāng)人體內(nèi)多柔比星的累積劑量接近為30 mg/m2,會(huì)發(fā)生亞急性心肌萎縮的結(jié)論一致[25]。對(duì)心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)多柔比星藥物濃度達(dá)4 mg/kg 是心肌細(xì)胞萎縮的開始,顯微鏡下可見心臟中段橫截面積與心肌細(xì)胞橫截面積明顯縮小。既往有觀點(diǎn)認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡亦可能導(dǎo)致了心臟萎縮[26-27],本次課題組對(duì)心肌組織的凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 的觀察佐證了此觀點(diǎn):3 mg/kg 濃度的多柔比星組凋亡蛋白Cleaved-caspase3 表達(dá)及Bax/Bcl2 比值相較NS 組未見明顯上升,而當(dāng)多柔比星濃度達(dá)到4 mg/kg 后,心臟中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達(dá)及Bax/Bcl2 的比值均明顯上升。在4～6 mg/kg 給藥濃度范圍內(nèi)可見凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達(dá)及Bax/Bcl2 的比值呈劑量依賴性上升,課題組不同劑量多柔比星對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的體外研究(數(shù)據(jù)未發(fā)布)亦佐證了體內(nèi)的趨勢(shì)。

除了心肌細(xì)胞萎縮、凋亡外,心肌纖維化也是導(dǎo)致心室重構(gòu)的另一中病理表現(xiàn)[28]。為了探討不同濃度多柔比星對(duì)小鼠心臟纖維化程度的影響,課題組對(duì)不同劑量多柔比星處理后小鼠的心臟石蠟切片采用天狼猩紅染色,結(jié)果顯示3 mg/kg 多柔比星組小鼠相較NS 組心肌纖維化比例未見明顯增加,當(dāng)多柔比星濃度達(dá)到4 mg/kg 時(shí),可見明顯的膠原沉積在心臟間質(zhì)中,心肌纖維化加重,4～6 mg/kg模型組小鼠心肌纖維化程度明顯比3 mg/kg 模型組嚴(yán)重,但3 組模型組組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),小鼠心肌纖維化程度大約一致,并未隨著多柔比星濃度與劑量的進(jìn)一步增多而加重,可能是由于多柔比星劑量累積到一定程度后,小鼠心臟纖維化程度不具備明顯的劑量依賴性特征,或者是給藥后觀察時(shí)長不夠?qū)е隆?/p>

本研究尚存一些不足之處,未對(duì)小鼠心功能、血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),但是本研究通過心臟重量、心脛比、心重比、心臟組織HE 染色、WGA 染色、天狼猩紅染色及凋亡蛋白檢測(cè)等指標(biāo)從側(cè)面反映了多柔比星可誘導(dǎo)小鼠心室重構(gòu),相較心超更具說服力。本研究也未從藥物時(shí)間依賴性角度對(duì)多柔比星誘導(dǎo)小鼠心臟損傷進(jìn)行研究,有待后續(xù)更進(jìn)一步深入探討。

綜上所述,當(dāng)多柔比星給藥濃度達(dá)到4 mg/kg時(shí),小鼠心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,可見心臟縮小,心肌細(xì)胞萎縮,心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化等,當(dāng)給藥濃度達(dá)到7 mg/kg 時(shí),小鼠多數(shù)死亡,反應(yīng)出多柔比星造模小鼠心臟損傷窗口比較窄,4～6 mg/kg 可作為多柔比星誘導(dǎo)小鼠慢性心臟損傷模型的參考濃度。本實(shí)驗(yàn)從整體上對(duì)不同濃度給藥劑量的多柔比星模型組的誘導(dǎo)的心臟損傷加以全面地評(píng)價(jià)、分析并提供安全、可靠的給藥劑量。