李夢媛,張文龍,楊星九,朱紫薇,張國新,魏育敏,高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,國家人類疾病動物模型資源庫,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是一種能夠在細胞質和細胞核中穿梭的高度保守的RNA 結合蛋白,屬于hnRNPKs 家族成員。HNRNPK 在人類基因中廣譜表達,能夠作用于細胞的轉錄、翻譯、染色體重塑等多種生理功能[1-2]。HNRNPK 能夠參與腫瘤生長和轉移等調控,多種腫瘤的形成和發(fā)展都與HNRNPK 密切相關[1-4]。當前研究顯示,HNRNPK在人肺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達,其表達增多通常與惡性腫瘤患者的預后負相關[3-4]。原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是世界最高發(fā)的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第5 位,其發(fā)病機制復雜,死亡率高,且發(fā)病率逐年上升[5]。已有研究證實HNRNPK 在肝癌組織細胞核中表達上調,并且隨著肝癌細胞密度的增加,表達逐漸增強,乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染還有可能會促進HNRNPK 的表達[6]。目前,HNPNPK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制尚未完全明確。本研究構建了通過強力霉素(doxycycline,DOX)誘導系統(tǒng)實現時間可控性HNRNPK 沉默的HepG2 細胞穩(wěn)轉株,為研究肝癌發(fā)病機制與治療手段提供了實驗工具。

1 材料和方法

1.1 細胞

HepG2 細胞系為本實驗室凍存。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol 試劑、反轉錄試劑盒購自Thermo 公司；SYBR green 熒光染料購自Toyobo 公司；HNRNPK抗體、HRP 標記的二抗購自Abcam 公司；c-Myc、c-Jun 等抗體購自CST 公司；CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技有限公司；定量PCR 專用96 孔板購自Life公司；細胞培養(yǎng)板、Transwell 嵌套24 孔板等購自Corning 公司。實時熒光定量PCR 儀和酶標儀購自BIO RAD 公司；拍照顯微鏡為Zeiss Axio Imager Z2光學顯微鏡。

PCR 實驗所用引物由英濰捷基公司合成。HNRNPK 的siRNA 序列為5’-GAGCTTCGATCAAAA TTGA-3’,由本實驗室設計并提供給吉凱基因進行慢病毒載體的構建。

1.3 實驗方法

1.3.1 穩(wěn)轉株的構建

按吉凱基因操作手冊進行HepG2 細胞的轉染。將處于對數生長期的HepG2 細胞接種于6 孔板,18 h 后,加入MOI=10 的病毒,8 h 后更換新鮮的培養(yǎng)基。并在72 h 后,用工作濃度為2 μg/mL 的嘌呤霉素繼續(xù)篩選48 h。觀察細胞狀態(tài),用含有1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基維持并擴大培養(yǎng)陽性細胞。

1.3.2 HNRNPK 下調的HepG2 細胞的形態(tài)觀察

將構建的HepG2 穩(wěn)轉株細胞接種于細胞培養(yǎng)板,用DOX 誘導HNRNPK 下調。48 h 后觀察HNRNPK 下調后HepG2 細胞的形態(tài)。

1.3.3 Real time PCR 檢測HNRNPK 的下調水平

將構建的HepG2 穩(wěn)轉株細胞接種于12 孔板,分別用0、1、2、5、10 μg/mL 濃度的DOX 誘導HNRNPK 下調。48 h 后,使用TRIzol 試劑裂解細胞并提取RNA,并進行反轉錄。采用Real-time PCR檢測HNRNPK mRNA 的相對表達量。HNRNPK 與GAPDH 基因的上下游引物以及PCR 反應體系參考本課題組前期研究[7]。通過HNRNPK mRNA 的相對表達量確定DOX 誘導HepG2 細胞HNRNPK 下調的最適濃度。

1.3.4 Western blot 檢測HNRNPK 的表達

接種構建的HepG2 穩(wěn)轉株細胞,通過DOX 誘導HNRNPK 下調,48 h 后收集細胞。通過RIPA 裂解液冰上裂解并提取蛋白,加入5×loading buffer 煮沸制成蛋白樣品,進行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結束后按300 mA 恒流轉膜90 min,用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h 后,用HNRNPK 一抗(1 ∶1000 稀釋)4℃孵育過夜。次日,用HRP 標記的二抗(1 ∶10000 稀釋)室溫孵育1 h,顯影檢測目的蛋白。

1.3.5 CCK-8 法檢測細胞增殖

于96 孔板按3×103個/孔的密度接種穩(wěn)轉株細胞,用DOX 誘導HNRNPK 下調。接種當天取1 組培養(yǎng)上清,加入CCK-8 試劑(1 ∶100 稀釋),按照CCK-8 檢測試劑盒說明書檢測OD450,隨后每24 h檢測1 次,直至96 h。

1.3.6 細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖

按1×103個/孔的密度將穩(wěn)轉株細胞接種于6孔板。DOX 誘導HNRNPK 下調后,在顯微鏡下觀察克隆大小。待孔中大多數單個克隆中細胞數大于50 時終止實驗,用4%多聚甲醛固定細胞,洗滌細胞后用0.1%的結晶紫染色,洗去多余的結晶紫后,在顯微鏡下觀察計算單克隆數并拍照。

1.3.7 劃痕實驗檢測細胞遷移

按2.5×105個/孔的密度將穩(wěn)轉株細胞接種于12 孔板。細胞貼壁后用200 μL 槍頭豎直劃線。除去孔中漂浮的細胞,用含DOX 與1%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。在劃痕后第48 h 拍照記錄細胞遷移狀態(tài)。

1.3.8 Transwell 實驗檢測細胞遷移

將穩(wěn)轉株細胞接種于6 孔板,用DOX 誘導HNRNPK 下調。次日,用胰酶消化重懸細胞,并用無血清培養(yǎng)基離心洗滌兩次除去血清,隨后用含DOX 的無血清培養(yǎng)基重懸并制備細胞懸液。在24孔板(下室)中加入500 μL 含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,在Transwell 小室(上室)中加入含有DOX的150 μL 細胞懸液。將Transwell 小室浸入24 孔板中,繼續(xù)誘導培養(yǎng)24 h。除去Transwell 小室中的培養(yǎng)基,PBS 洗滌后用甲醇于室溫固定細胞。用PBS 洗去多余的甲醇后,用0.1%的結晶紫染色。最后用ddH2O 洗去多余的結晶紫,并用棉簽小心除去Transwell 小室腔內多余的細胞,揭下基底膜固定于載玻片,用中性樹脂封片,晾干后在顯微鏡下觀察并計算遷移細胞的數量。

1.3.9 Western blot 檢測相關信號通路

檢測步驟同1.3.4,通過Western blot 方法檢測β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7、CCND1、Cyclin-D1等蛋白的表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

通過GraphPad Prism V.5.0 軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學分析及t檢驗,數據以平均數±標準差()表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HNRNPK 沉默不影響HepG2 細胞的形態(tài)

實驗結果如圖1 所示,DOX 誘導HNRNPK 下調后,HepG2 細胞在形態(tài)上無明顯變化,但與對照病毒組比較,細胞密度稍有不同,可能是增殖能力受到影響,具體差異需進一步實驗分析。

圖1 HNRNPK 下調的HepG2 細胞形態(tài)Figure 1 Cellular morphology of HepG2 cells after HNRNPK downregulation

2.2 HepG2 穩(wěn)轉株中HNRNPK 的表達顯著下調

實驗結果如圖2A 所示,DOX 誘導后HepG2 穩(wěn)轉株中HNRNPK mRNA 顯著下調。在DOX 的濃度為5、10 μg/mL 時,HNRNPK 均能下調約60%,且二者之間無顯著差異,顯示5 μg/mL 是DOX 誘導HNRNPK 下調的最適濃度。進一步檢測HNRNPK蛋白水平的表達,如圖2B、圖2C 所示,用工作濃度為5、10 μg/mL 的DOX 誘導細胞,HNRNPK 表達同樣下調。

圖2 不同濃度DOX 誘導HNRNPK 下調(n=3)Note.A,qPCR.B,Western blot.C,Relative protein expression of HNRNPK.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 2 HNRNPK downregulated by different doses of DOX

2.3 HNRNPK 下調抑制了HepG2 細胞的增殖

實驗結果如圖3 所示,檢測HepG2 細胞的增殖能力,經統(tǒng)計學分析,與對照組比較,HNRNPK 下調的HepG2 細胞增殖能力明顯減弱,并且單克隆數量明顯減少,表明HNRNPK 下調顯著抑制了HepG2細胞的增殖。

圖3 HNRNPK 下調抑制HepG2 細胞的增殖(n=3)Note.A,CCK-8 assay.B,Colony formation assay.C,Colony number.Compared with the control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 3 HNRNPK downregulation inhibited the proliferation of HepG2 cells

2.4 HNRNPK 下調抑制了HepG2 細胞的遷移

實驗結果如圖4 所示,通過劃痕實驗與Transwell 實驗檢測HepG2 細胞的遷移能力,經統(tǒng)計學分析,HNRNPK 下調的HepG2 細胞的遷移距離明顯減小,并且穿過基底膜的細胞數量明顯減少,表明HNRNPK 下調顯著抑制了HepG2 細胞的遷移。

圖4 HNRNPK 下調抑制HepG2 細胞的遷移(n=3)Note.A,Wound healing assay.B,Transwell assay.Compared with the control group,***P＜0.001.Figure 4 HNRNPK downregulation inhibited the migration of HepG2 cells

2.5 HNRNPK 下調對HepG2 細胞增殖與遷移相關的信號通路的抑制

實驗結果如圖5 所示,檢測穩(wěn)轉株細胞中增殖與遷移相關的信號通路的蛋白表達。HNRNPK 下調后,HepG2 細胞中的 Cyclin-D1、CCND1、β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7 等蛋白表達均降低。

圖5 HNRNPK 下調抑制HepG2 細胞增殖與遷移相關的信號通路(n=3)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 5 HNRNPK downregulation inhibited related signaling pathways of proliferation and migration in HepG2 cells

3 討論

與正常人比較,HNRNPK 在慢性HBV 性肝炎、肝炎后肝硬化及乙肝相關性原發(fā)性肝癌患者的血清、尿液中表達上調,表明其與乙肝相關性原發(fā)性肝癌具有相關性[8]。并且,HNRNPK 同樣在肝癌組織細胞核中表達上調,其表達隨著肝癌細胞密度的增加逐漸增強,提示HNRNPK 的高表達可能與肝癌細胞惡性轉化和腫瘤發(fā)展密切相關[6]。長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNAs,lncRNAs) 是HNRNPK 的主要調節(jié)因子,二者相互作用能夠調控基因的轉錄與翻譯[3]。Qin 等[9]通過研究證實一種名為p53 穩(wěn)定和激活RNA (p53-stabilizing and activating RNA,PSTAR)的lncRNA 能夠通過抑制HNRNPK 的去類泛素化促進p53 信號傳導,從而抑制肝癌細胞的增殖。

Zhang 等[10]發(fā) 現 lncRNA CASC11 能夠與HNRNPK 相互作用激活Wnt/β-Catenin 信號通路,繼而促進結直腸癌的生長轉移。Liu 等[11]研究證實Wnt/β-Catenin 信號通路能夠參與HNRNPK 驅動的頭頸鱗癌增殖和遷移抑制過程。Wnt/β-Catenin 通路在肝臟發(fā)育、再生和肝癌發(fā)生過程中也起著重要作用[12],已有研究顯示激活Wnt/β-Catenin 通路能夠促進HepG2 細胞的增殖和遷移,因而該通路的激活能夠促進肝癌的發(fā)展,是肝癌發(fā)生的重要分子機制[13]。當Wnt/β-Catenin 信號通路被激活時,包括Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc 和基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)在內的下游靶向基因也被異常激活[14]。MMPs 能降解細胞外基質中的各種蛋白成分、生長因子和細胞表面受體,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,從而被認為是腫瘤浸潤轉移過程中主要的蛋白水解酶[15]。HNRNPK 能夠激活Ras-raf-MARK 信號通路,上調在腫瘤轉移中起關鍵性作用的相關基因,如MMP3、MMP10 等[16]。肝癌組織中β-Catenin 的異常表達通常與MMP-7 呈正相關[17]。本實驗中,當HNRNPK 下調時,HepG2 細胞中的β-Catenin 表達水平也降低,同時其通路下游的Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc、MMP7 表達受到抑制。表明HNRNPK 的下調抑制了Wnt/β-Catenin 通路的激活,因而抑制其下游MMP7 等一系列調控細胞遷移的靶基因表達,最終導致HepG2 細胞的遷移受到抑制。此外,已有研究證實HNRNPK 能夠參與細胞周期G0/G1 期與調控Cyclin-D1 開關蛋白2,從而影響膀胱癌細胞增殖和凋亡[18]。原癌基因Cyclin-D1由CCND1 基因所編碼,是一種G1/S 期特異性周期蛋白。Cyclin-D1 在多種腫瘤中均被發(fā)現基因過表達,過表達的Cyclin-D1 能夠導致細胞癌變[19]。本實驗中,HNRNPK 的下調抑制了CCND1 與Cyclin-D1 的表達,可能導致細胞周期阻滯,抑制了HepG2細胞的增殖。

本實驗構建了由DOX 誘導系統(tǒng)調控HNRNPK穩(wěn)定下調的HepG2 細胞株,能夠實現時間可控性HNRNPK 表達,為進一步研究HNRNPK 對腫瘤形成時間以及腫瘤轉移的影響及作用機制提供了更便利的條件與良好的實驗基礎。當前的研究報導顯示,雖然HNRNPK 在多種惡性腫瘤中均顯示出異常表達的現象,其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的具體作用卻不甚相同[20-22],因此不能單純地將HNRNPK 劃分為癌基因或抑癌基因。HNRNPK 在腫瘤中發(fā)揮的具體生物學功能可能與其和不同蛋白、RNA 相互作用從而參與多種信號通路的調控有關。綜上所述,HNRNPK 的下調抑制了肝癌細胞HepG2 的增殖與遷移,表明HNRNPK 的異常表達可能促進了肝癌的發(fā)展、且對多種腫瘤都有著至關重要的影響,深入研究HNRNPK 的作用機制可能為臨床腫瘤治療和預后提供新的思路。