肖志剛 鄭 麗 王梓瀛 劉 昆 王 瑜齊錦生*栗彥寧

(1.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部,石家莊 050017；3.邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河北 邢臺 054000)

原發(fā)性肝癌是全球第四位的致死性癌癥,我國肝癌發(fā)病人數(shù)占全球一半以上,其中,肝細(xì)胞來源的肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)約占90%,是原發(fā)性肝癌中最常見的類型[1]。目前,針對HCC 治療主要以手術(shù)切除為主,切除率低及復(fù)發(fā)率高等,嚴(yán)重影響了病人生存率,亟需治療新思路[2-3]?；谂咛ジ杉?xì)胞和腫瘤細(xì)胞有很多共同特性,例:可塑性、永生化、免疫逃逸等,齊錦生教授提出“同源同步誘導(dǎo)分化”理論,即腫瘤是發(fā)育受阻于某個(gè)階段而無限增殖的“干細(xì)胞”或是“返祖細(xì)胞”,而胚胎發(fā)育過程包含了所有組織細(xì)胞的所有發(fā)展階段,用相同組織來源、發(fā)育階段匹配的胚胎干細(xì)胞可誘導(dǎo)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞分化,且根據(jù)越原始越相似的理論,這種誘導(dǎo)作用是不受種屬限制的[4-6]。在此理論指導(dǎo)下,本課題組前期研究證實(shí)小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化,但機(jī)制尚未闡明[5-6]。已知,高度保守的Wnt/β-Catenin 信號通路與發(fā)育、分化等密切相關(guān),也是促進(jìn)HCC 分化的重要因素[7-8]。那么,小鼠第13.5 天的胚肝細(xì)胞是否通過調(diào)控β-Catenin,誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化,尚不清楚。本文以小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞株體外共培養(yǎng)模型,研究了小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞調(diào)控β-Catenin,誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化機(jī)制,為HCC 治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康KM 小鼠,雄鼠30 只,雌鼠90 只,體重25～30 g,6～8 周齡,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK(冀)2018-004],飼養(yǎng)條件如下:自由進(jìn)食和飲水,溫度約25℃,濕度約50%,12 h 光照/12 h 黑暗,在河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)動物[SYXK(冀)2018-008],動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)(2018-0042),實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則,給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2,購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(TCHu 72)。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自北京全式金公司(貨號:FS101)；Gibco 的DMEM 培養(yǎng)基(貨號:C11885500BT)購自Life Technology 公司；Millicell 細(xì)胞培養(yǎng)小室(貨號:PICMORG50)購自美國Millipore 公司；β-Catenin 抑制劑XAV-939 購自Selleck(貨號:S1180)；白蛋白(ALB,貨號:sc-271605)、甲胎蛋白(AFP,貨號:sc-8399)、肝細(xì)胞核因子4α(HNF-4α,貨號:sc-374229)、β-Catenin 抗體(貨號:sc-7963)、β-actin(貨號:sc-8432)購自美國Santa Cruz 公司；TRITC 標(biāo)記二抗(貨號:BA1089) 購自博士德公司；DAPI (2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,貨號:D9542-1MG)購自SIGMA 公司；TRIzol 試劑(貨號:15596-026)購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:K1622)購自Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ,貨號:RR820A)購自日本TaKaRa 公司；PCR 引物由上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；0.45 μm PVDF 膜(貨號IPVH00010)購自美國Merk miliplore公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(英國NEW BRUNSWICK 公司,型號:Galaxy 170R)；體視顯微鏡(德國Leica 公司產(chǎn)品,型號:S9)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司產(chǎn)品,型號:IX-51)；PCR 儀(美國Thermo 公司產(chǎn)品,型號:PX2)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(中國香港Gene 公司產(chǎn)品,型號:Corbett Rotor-Gene 3000)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(中國香港Gene 公司產(chǎn)品,型號:9120)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞分離純化

采用本實(shí)驗(yàn)室方法,用6～8 周齡KM 小鼠,雌鼠:雄鼠=3 ∶1 合籠,次日出現(xiàn)陰栓日期為妊娠0.5 d,取13.5 d 孕鼠,消毒,在體視顯微鏡下取出胚肝,分離成小塊,采用Ⅳ型膠原酶消化。過濾網(wǎng)后,采用差速貼壁法純化胚肝細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng),備用于鑒定及共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[5-6]。

1.3.2 小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞株的共培養(yǎng)

將HepG2 細(xì)胞株置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液為高糖培養(yǎng)基,含1%的非必需氨基酸,10%的新生牛血清。利用“Transwell”小室建立小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞株的非接觸式共培養(yǎng)模型,1 mL 胚肝細(xì)胞(每毫升1×106個(gè))培養(yǎng)于六孔板中“Transwell”小室上層膜上,2 mL HepG2(每毫升5×104個(gè))培養(yǎng)于六孔板中,于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為對照組、共培養(yǎng)組,培養(yǎng)24、48 h 后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 β-Catenin 抑制劑處理及分組

建立小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞株的共培養(yǎng)模型后,給予β-Catenin 抑制劑XAV-939處理,分為對照組、XAV-939 組(1 μmol/L)、共培養(yǎng)+XAV-939 組(1 μmol/L)、共培養(yǎng)組,作用48 h 后,相差顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞株形態(tài),同時(shí)檢測AFP、β-Catenin 的蛋白含量。

1.3.4 免疫熒光法檢測ALB 的分布

取原代胚肝細(xì)胞,4%多聚甲醛固定后,1%的TritonX-100 室溫下處理30 min,10%山羊血清37℃封閉1 h。棄除封閉液,加入AFP 抗體(1:50),4℃孵育過夜,加入FITC 標(biāo)記二抗(1 ∶50),避光37℃孵育1 h,加入細(xì)胞核染色液DAPI,避光室溫作用15 min,滴加適量的抗熒光衰減封片液(50%甘油),蓋玻片封片后熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。ALB 的染色為綠色,細(xì)胞核的染色為藍(lán)色。采用Image Pro Plus 6.0 版軟件計(jì)數(shù)3 個(gè)隨機(jī)視野中免疫熒光陽性細(xì)胞。

1.3.5 qRT-PCR 檢測mRNA 水平

收集共培養(yǎng)24 h、48 h 的HepG2 細(xì)胞株,采用TRIzol 法提取RNA,并測定RNA 濃度。按照試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件:95℃30 s,95℃5 s,60℃20 s,72℃20 s,第2 步至第3 步進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算相關(guān)基因的mRNA 的相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primers for Real-time PCR

1.3.6 Western blot 檢測蛋白含量

共培養(yǎng)及β-Catenin 抑制劑處理48 h 后,收集HepG2 細(xì)胞株,用RIPA 裂解液進(jìn)行裂解,取上清至預(yù)冷的EP 管中,即為細(xì)胞總蛋白提取物。蛋白精準(zhǔn)定量后,取蛋白樣品每孔150 μg 經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂牛奶封閉后,一抗封閉(5%牛奶1 ∶200 稀釋),4℃過夜,二抗(5%牛奶1 ∶2000 稀釋)室溫孵育2 h,采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)讀取圖像。將所得圖片用美國UVP 公司LabWorks 4.5 軟件對條帶進(jìn)行定量分析,計(jì)算目的條帶的灰度值。

1.3.7 免疫熒光法檢測β-Catenin 的分布

方法同1.3.2,共培養(yǎng)48 h 的HepG2 細(xì)胞株,使用β-Catenin 抗體(1:50)和TRITC 標(biāo)記的二抗,檢測β-Catenin 蛋白的分布。β-Catenin 的染色為紅色,細(xì)胞核的染色為藍(lán)色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所得結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()。兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,多組之間分析先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用One-Way-ANOVA 法,進(jìn)一步兩兩比較,采用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠13.5 天胚肝細(xì)胞的鑒定

原代胚肝細(xì)胞分離培養(yǎng)后,用免疫熒光法檢測肝細(xì)胞標(biāo)記分子ALB 蛋白的分布。結(jié)果顯示,91.84%的ALB 熒光染色陽性,見圖1。

圖1 小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞鑒定Note.a,Bright field.b,ALB fluorescence.c,DAPI fluorescence.d,ALB and DAPI fluorescence merge.Figure 1 Identification of 13.5 day mouse embryo hepatocytes

2.2 qRT-PCR 檢測相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平

與對照組相比,共培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞株中AFP相對mRNA 表達(dá)量在24 h 和48 h 均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),HNF-4α相對mRNA 表達(dá)量在24 h和48 h 均顯著升高(P＜0.05,P＜0.01),CYP1B1 mRNA 的相對表達(dá)量在24 h 無明顯差異,48 h 顯著升高(P＜0.01),ADH1CmRNA 的相對表達(dá)量在24 h 無明顯差異,48 h 顯著升高(P＜0.01),見圖2。

圖2 共培養(yǎng)后相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平Note.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 2 mRNA expression levels of related genes after co-culture

2.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

對照組HepG2 細(xì)胞株生長旺盛、密度大,形態(tài)呈多角形或梭形,胞漿透亮,細(xì)胞核多且形狀不規(guī)則。與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后,HepG2 細(xì)胞株生長受到明顯抑制,形態(tài)多為六邊形,接近正常成熟肝細(xì)胞,胞漿透亮度下降,細(xì)胞核多為單核,見圖3。

圖3 對照組和共培養(yǎng)組HepG2 細(xì)胞株的形態(tài)Note.a,Control group.b,Co-culture group.Figure 3 Morphology of HepG2 cells in the control group and co-culture group

2.4 Western blot 法檢測 AFP、HNF-4α、β-Catenin 的蛋白含量

與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后,提取總蛋白,Western blot 法檢測HepG2 細(xì)胞株中,AFP、HNF-4α、β-Catenin 的蛋白含量。計(jì)算Western blot 條帶灰度值并統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,AFP 蛋白含量在共培養(yǎng)組(P＜0.05)顯著降低,HNF-4α 蛋白含量在共培養(yǎng)組顯著升高(P＜0.05)。同時(shí),與對照組相比,β-Catenin 蛋白含量在共培養(yǎng)組顯著下降(P＜0.05),見圖4。

圖4 共培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞株中AFP、HNF-4α 和β-Catenin 的蛋白表達(dá)Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 4 Protein expression levels of AFP、HNF-4 and β-Catenin in co-culture group

2.5 免疫熒光檢測β-Catenin 的分布

與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后,免疫熒光法檢測HepG2 細(xì)胞株中β-Catenin 的分布。結(jié)果可見,對照組HepG2 細(xì)胞株增殖旺盛,β-Catenin 的熒光染色明顯,提示其高含量；相比于對照組,共培養(yǎng)組HepG2 細(xì)胞株數(shù)量明顯減少,β-Catenin 的熒光強(qiáng)度顯著減弱。結(jié)果驗(yàn)證了,與小鼠第13.5 天胚肝共培養(yǎng)后,HepG2 細(xì)胞株中β-Catenin 的含量減少,見圖5。

圖5 HepG2 細(xì)胞株中β-Catenin 的分布Note.a,Bright field in the control group.b,β-Catenin fluorescence in the control group.c,DAPI fluorescence in the control group.d,β-Catenin and DAPI fluorescence merge in the control group.e,Bright field in the co-culture group.f,β-Catenin fluorescence in the co-culture group.g,DAPI fluorescence in the co-culture group.h,β-Catenin and DAPI fluorescence merge in the co-culture group.Figure 5 Distribution of β-Catenin in HepG2 cells

2.6 抑制β-Catenin 引起HepG2 細(xì)胞株形態(tài)變化

與對照組HepG2 細(xì)胞株相比,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理后,細(xì)胞生長受到抑制,胞漿透亮度下降,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,趨于死亡。而相對于共培養(yǎng)組,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理后,細(xì)胞形態(tài)變化的基礎(chǔ)上,接近崩解,見圖6。

圖6 抑制β-Catenin 引起HepG2 細(xì)胞株的形態(tài)變化Note.a,Control group.b,XAV-939 group.c,Co-culture group.d,Co-culture+XAV-939 group.Figure 6 Morphology of HepG2 cells induced by inhibition β-Catenin

2.7 抑制β-Catenin 減少AFP 的蛋白含量

對照及共培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞株,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理48 h 后,Western blot 法檢測AFP 和β-Catenin 的蛋白含量。與對照組相比,AFP 蛋白含量和β-Catenin 蛋白含量在XAV-939 組顯著降低(P＜0.01)；同時(shí),與共培養(yǎng)組相比,AFP 蛋白含量和β-Catenin 蛋白含量在共培養(yǎng)+XAV-939 組顯著降低(P＜0.01),見圖7。

圖7 抑制β-Catenin 減少AFP 的蛋白含量Note.Compared with the control group and the co-culture group,**P＜0.01.Figure 7 Reduced AFP protein content induced by inhibition β-Catenin

3 討論

目前,針對殺死腫瘤細(xì)胞的治療策略,不能達(dá)到完全治愈腫瘤的目的,反而會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。因此,我們必須改變思路。胚胎微環(huán)境是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的天然而有效的治療良方[4,9],然而,并不是所有的胚胎誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)都能取得成功[10],因此有必要探尋其內(nèi)在的誘導(dǎo)機(jī)制。

根據(jù)腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞之間的相似性[11-12],齊錦生教授提出“同源同步誘導(dǎo)分化”理論[5-6]。有證據(jù)表明,HCC 細(xì)胞表達(dá)胚胎抗原、具有無限增殖等胚肝細(xì)胞的特性[12-13]。在“同源同步誘導(dǎo)分化”理論的指導(dǎo)下,我們前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí),特定發(fā)育階段的雞胚或小鼠胚肝細(xì)胞可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化[6]。

鑒于小鼠胚肝細(xì)胞是在胚胎發(fā)育第12～15 天分化成熟[14],我們用小鼠第13.5～14.5 天胚肝細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞株共培養(yǎng),能抑制HepG2 細(xì)胞株增殖,促進(jìn)其分化成熟[5-6]。HNF-4α 在肝發(fā)育和肝細(xì)胞功能形成中,發(fā)揮著不可或缺的關(guān)鍵作用,也是控制肝細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光法檢測小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞中肝細(xì)胞標(biāo)記分子ALB 蛋白表達(dá),結(jié)果顯示絕大部分細(xì)胞的ALB 熒光染色陽性,說明小鼠第13.5天胚肝細(xì)胞成功分離培養(yǎng)。HepG2 細(xì)胞株與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)后,肝癌標(biāo)記分子AFP相對mRNA 表達(dá)量降低,而肝細(xì)胞分化調(diào)控因子HNF-4α,成熟肝細(xì)胞標(biāo)記分子CYP1B1、ADH1C基因相對mRNA 表達(dá)量升高。并且與小鼠13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株的形態(tài)趨于正常肝細(xì)胞樣。Western blot 結(jié)果顯示HepG2 細(xì)胞株中AFP、HNF-4α 蛋白在共培養(yǎng)后表達(dá)變化與相對mRNA 表達(dá)變化相一致。這表明,小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)可抑制HepG2 細(xì)胞株中AFP 表達(dá),上調(diào)HNF-4α 表達(dá),誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化。而HNF-4α 還調(diào)控很多成熟肝細(xì)胞特異酶的表達(dá),如CYP1B1和ADH1C等。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí),與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng),可上調(diào)HepG2 細(xì)胞株中CYP1B1和ADH1C的表達(dá)。然而,小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞是通過什么信號通路,誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化成熟呢?

已知Wnt/β-Catenin 信號通路是一個(gè)高度保守的,調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化的重要信號通路[17]。肝細(xì)胞分化過程中,Wnt/β-Catenin 信號通路起關(guān)鍵調(diào)控作用,而其紊亂或過度激活,則導(dǎo)致HCC 的發(fā)生發(fā)展[7-8]。Western blot 和免疫熒光結(jié)果均顯示與小鼠13.5 天胚肝共培養(yǎng)后,HepG2 細(xì)胞株中β-Catenin 蛋白含量下降。這說明與小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著抑制HepG2 細(xì)胞株中β-Catenin 的含量和分布。加入β-Catenin 抑制劑后,HepG2 細(xì)胞株出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化,細(xì)胞趨于死亡,采用Western blot 方法檢測蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制β-Catenin 可減少HepG2 細(xì)胞株以及共培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞株中AFP 蛋白含量。這說明抑制β-Catenin 可引起對照組及共培養(yǎng)組HepG2 細(xì)胞株明顯的形態(tài)變化,減少AFP 蛋白含量。但是,抑制β-Catenin 并不能完全模擬小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)的效果?？傊?這說明,小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)很可能是主要通過抑制Wnt/β-Catenin 信號通路,促使HepG2 細(xì)胞株分化成熟的。

然而,小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞還通過哪些信號通路,及怎樣抑制β-Catenin,誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化成熟,還需進(jìn)一步的深入探討。此外,胚胎發(fā)育和免疫形成之間亦是存在緊密的聯(lián)系[10]。因此,胚胎誘導(dǎo)分化與免疫治療之間內(nèi)在的聯(lián)系和機(jī)制,也需不斷探討揭示[18]。

總之,本研究揭示,小鼠第13.5 天胚肝細(xì)胞共培養(yǎng)可能主要通過抑制β-Catenin,誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株分化成熟。