劉子馨 賈飛凡 孟紅旭韓 笑李玲美尤 越王奧奧王紫艷楊 斌李 磊*付建華*劉建勛

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100091；2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)中心,北京 100091；3.中藥藥理北京市重點(diǎn)實驗室,北京 100091；4.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心,北京 100048；5.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院病理科,北京 100091)

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrheal,PD)是指伴隨月經(jīng)周期出現(xiàn)以下腹部疼痛為主要癥狀且無其他生殖器官器質(zhì)性病變的疾病,是最常見的婦科疼痛性疾病,占痛經(jīng)的90%以上[1],在不同年齡、國籍的女性人群中發(fā)病率占45%～97%不等,可以占到學(xué)校與工作缺勤原因的1%～3%[2]。原發(fā)性痛經(jīng)屬于中醫(yī)“經(jīng)行腹痛”的范圍。清代陳蓮舫所著《女科秘訣大全》中將經(jīng)行腹痛稱為“痛經(jīng)”,后世醫(yī)者沿用此名。針對原發(fā)性痛經(jīng)的治療,西醫(yī)臨床常使用非甾體抗炎藥和避孕藥[3],此類藥物主要作用靶點(diǎn)為前列腺素,通過抑制前列腺素緩解疼痛[4]。然而長期使用非甾體抗炎藥和口服避孕藥對肝、腎、胃腸功能甚至心臟系統(tǒng)都有許多副作用[5]。中醫(yī)臨床常使用四物湯及其類方或佐以針灸、穴位貼敷、耳穴、熏蒸、灌腸等方法,療效顯著且副作用少[6-8]。四物合劑始載于2000 年版《中國藥典》一部[9],源于中醫(yī)經(jīng)典方劑“四物湯”其組成成分為:當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎。四物湯最早記載于唐代藺道人所著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》,后世應(yīng)用較為廣泛的藥方則取自宋代《太平惠民和劑局方》中,具有調(diào)經(jīng)止痛、補(bǔ)血活血的功效,主治沖任虛損、月水不調(diào)……經(jīng)行腹痛等婦人諸疾[10]。方中當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)肝,和血調(diào)經(jīng),熟地黃補(bǔ)血滋陰,佐以白芍和營柔肝,川芎活血行滯,通暢氣血,被稱為“婦科第一方”是治療婦科疾患的基礎(chǔ)方。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析得出四物湯治療PD 的關(guān)鍵作用機(jī)制為舒張子宮、調(diào)節(jié)激素、抗炎鎮(zhèn)痛等[3]?；诖?本研究旨在探究四物合劑治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

KM 雌性小鼠60 只,SPF 級,體重18～22 g,由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。動物飼養(yǎng)、實驗操作均在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(京)2018-0018]進(jìn)行。實驗動物處置嚴(yán)格遵循“減少、替代、優(yōu)化”的3R 原則,給予人道主義關(guān)懷。本研究獲得中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(2022XLC001)。

1.2 主要試劑與儀器

四物合劑,神威藥業(yè)(四川)有限公司提供,每瓶10 mL,批號2001141,有效期至2022 年1 月,根據(jù)2020 年版《中國藥典》一部計算,每1 mL 四物合劑相當(dāng)于1 g 生藥；縮宮素注射液,上海禾豐制藥有限公司,1 mL:10 單位,批號:09201009,有效期至2022 年10 月；苯甲酸雌二醇注射液,寧波第二激素廠,2 mL:4 mg,批號:2011051,有效期至:2022 年10月；痛經(jīng)寶顆粒,仲景宛西制藥股份有限公司,每袋10 g,批號:200704。

丙二醛(SOD)測定試劑盒:南京建成生物工程有限公司,貨號:A001-3-2；超氧化歧化酶(MDA)測定試劑盒:南京建成生物工程有限公司,貨號:A003-1-2；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA 試劑盒:上海江萊生物科技有限公司,貨號:JL13273；白介素6(IL-6)ELISA 檢測試劑盒:上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:ml002293-C；腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒:上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:ml002095-C；環(huán)氧合酶-2 抗體(COX-2):proteintech,貨號:66351-1-lg。多功能酶標(biāo)儀:BioTek 公司(美國)SYNERGY44型；低溫冷凍離心機(jī):Thermo Fisher Scientific 公司(美國)MP-150 型。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

正常雌性小鼠60 只,隨機(jī)均分成4 組,即空白組、模型組、陽性藥痛經(jīng)寶顆粒組(4 g/kg)、四物合劑組(8 mL/kg),按照藥品說明書給藥方式設(shè)置給藥劑量,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后各組給予相應(yīng)藥物灌胃給藥。

1.3.2 造模與給藥

小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(2 mg/kg),每日1次,連續(xù)10 d。第4 天開始,空白組與模型組給予等劑量蒸餾水,痛經(jīng)寶組按4 g/kg 給藥,四物合劑組每日按8 mL/kg 給藥,每日給藥1 次,連續(xù)給藥7 d。

1.3.3 扭體次數(shù)、潛伏期測定

末次注射苯甲酸雌二醇后1 h,按10 U/kg 腹腔注射縮宮素,制備小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型。小鼠腹腔注射10 U/kg 縮宮素后,即刻放入透明的觀察箱中,觀察記錄小鼠首次出現(xiàn)扭體時的潛伏期以及小鼠30 min 內(nèi)所有扭體次數(shù),計算出藥物扭體反應(yīng)抑制率。觀察標(biāo)準(zhǔn):小鼠腹腔出現(xiàn)內(nèi)凹,以及軀干與后肢伸展,臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋。抑制率(%)=(模型組扭體反應(yīng)均數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)均數(shù))/模型組扭體反應(yīng)均數(shù)×100%。

1.3.4 血清MDA、SOD 檢測

觀察出現(xiàn)扭體反應(yīng)30 min 后,進(jìn)行小鼠麻醉。小鼠眼底靜脈叢取血放至不含抗凝劑試管中,室溫下靜置1 h 后,3500 r/min 離心,離心10 min 后取上清。用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)檢測血清SOD 活性,硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清MDA 含量。

1.3.5 ELISA 法檢測子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α

小鼠眼底靜脈叢取血后,冰上迅速摘取小鼠新鮮的子宮組織,預(yù)冷的PBS 沖洗子宮組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS 按1 ∶9 加入勻漿器中,充分研磨,將勻漿液于7300 r/min,離心10 min,取上清檢測。ELISA 檢測子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α 的含量。以上均嚴(yán)格按照說明書要求操作。

1.3.6 子宮HE 染色與免疫組化

取出子宮組織后用4%多聚甲醛固定24 h 后,石蠟包埋,制備子宮組織切片,HE 染色后顯微鏡下觀察子宮組織。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,0.3%H2O2氧化15 min,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加一抗COX-2(1 ∶200 稀釋)4℃過夜,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加EnVision II 抗,室溫60 min,PBS 洗3遍,每遍5 min。每張切片加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液,顯微鏡下觀察3 min,陽性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色,蘇木素復(fù)染,0.1%鹽酸分化,自來水沖洗,PBS 沖洗返藍(lán),梯度乙醇脫水,透明,封片。采用Image J 統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,計量資料結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()示,將測定數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗,組間比較采用t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠扭體反應(yīng)及潛伏期檢測

與正常組相比較,模型組30 min 內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)顯著增多(P＜0.01),潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。與模型組比較,陽性藥組30 min 扭體次數(shù)增加(P＜0.05)四物合劑組30 min 內(nèi)扭體次數(shù)顯著減少,潛伏期明顯增加(P＜0.01,P＜0.05),見表1。

表1 各組原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型潛伏期、扭體次數(shù)(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

表1 各組原發(fā)性痛經(jīng)小鼠模型潛伏期、扭體次數(shù)(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 小鼠血清SOD、MDA 含量測定

與正常組相比,模型組、陽性藥組、四物合劑組小鼠血清中SOD 無顯著性差異；與正常組相比,模型組血清MDA 顯著增加(P＜0.01)；與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組血清MDA 顯著降低(P＜0.01),見表2。

表2 各組原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

表2 各組原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01.

2.3 小鼠子宮勻漿PGF2α、IL-6、TNF-α 測定

與正常組相比,模型組子宮組織中PGF2α顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比,陽性藥組PGF2α顯著降 低(P＜0.01),四物合劑組PGF2α降低(P＜0.05)；與正常組相比,模型組子宮組織IL-6、TNFα 增加(P＜0.05),與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組子宮組織IL-6、TNF-α 降低(P＜0.05),見表3。

表3 各組原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

表3 各組原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

注:與正常組比較,#P＜0.05,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,#P＜0.05,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.4 小鼠子宮組織病理觀察

小鼠子宮組織病理分析見圖1。正常組小鼠子宮腺體多,腔大飽滿,間質(zhì)疏密均勻,血管豐富,內(nèi)膜上皮固有層結(jié)構(gòu)緊密,間質(zhì)細(xì)胞豐富,未見明顯異常。

圖1 原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠HE 染色切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 1 HE staining sections of primary dysmenorrhea model mice

模型組子宮內(nèi)膜腺體擴(kuò)張,呈乳頭狀增生,間質(zhì)水腫血管擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤,說明模型制備成功。與模型組相比,陽性藥組小鼠子宮水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕,四物合劑組小鼠子宮腺腔見少量炎癥細(xì)胞浸潤。

2.5 小鼠子宮組織COX-2 表達(dá)

與正常組相比,模型組子宮組織COX-2 表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組子宮組織COX-2 表達(dá)降低(P＜0.05),見圖2、圖3。

圖2 原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠COX-2 免疫組化切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 2 COX-2 immunohistochemical section of primary dysmenorrhea model mice

圖3 COX-2 在小鼠子宮組織中的表達(dá)Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01Figure 3 Expression of COX-2 in mice uterus

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)病位在子宮,變化在氣血主要病機(jī)為“不榮則痛、不通則痛”[4]。清代《傅青主女科》的“舒則通暢,郁則不揚(yáng),經(jīng)欲行而肝不應(yīng),則抑拂其氣而疼生”進(jìn)一步闡明原發(fā)性痛經(jīng)形成原因為體虛、寒、氣郁、血結(jié)等。四物合劑組成成分為:當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎,具有益氣活血、補(bǔ)血養(yǎng)血功效,為臨床治療原發(fā)性痛經(jīng)常用藥物。

縮宮素誘發(fā)的小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型是被廣泛認(rèn)可的痛經(jīng)藥效學(xué)實驗?zāi)Ｐ?常應(yīng)用于原發(fā)性痛經(jīng)的研究[11]。原發(fā)性痛經(jīng)的主要臨床癥狀是劇烈的急性腹痛,因此采用扭體反應(yīng)為主要指標(biāo)用來評價實驗藥物的療效[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組小鼠30 min 內(nèi)扭體次數(shù)顯著增加,潛伏期縮短,陽性藥組、四物合劑組有效降低了PD 模型小鼠30 min 內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù),延長疼痛潛伏期,說明四物合劑可拮抗縮宮素誘發(fā)的小鼠急性腹痛。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性痛經(jīng)與子宮內(nèi)膜平滑肌陣發(fā)性收縮所導(dǎo)致的肌間血管受壓而引起的子宮肌層及內(nèi)膜暫時性缺血,產(chǎn)生過多自由基有關(guān)[14]。MDA 是脂質(zhì)過氧化代謝的重要產(chǎn)物,可引起細(xì)胞損傷,其含量可間接反映子宮細(xì)胞受自由基損傷的嚴(yán)重程度[15]。研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組小鼠血清MDA 水平顯著增加,陽性藥組、四物合劑組血清MDA 水平較模型組降低說明四物合劑組小鼠子宮組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度低,提示四物合劑在一定程度上減少子宮氧化應(yīng)激水平。

子宮內(nèi)膜是合成前列腺素的重要部位,研究表明,PD 的病因是子宮前列腺素(PGs)的過多分泌使子宮過度收縮[5],前列腺素的生物合成在疼痛模型的疼痛機(jī)制中有重要作用[16]。特別是PGF2α刺激子宮收縮、缺血,導(dǎo)致月經(jīng)痛[5]。與正常組相比,模型組小鼠子宮組織中的PGF2α水平顯著增高,陽性藥組、四物合劑組小鼠子宮組織PGF2α水平較模型組降低。炎癥與痛經(jīng)息息相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性痛經(jīng)的主要機(jī)制與前列腺素、白細(xì)胞介素的增高密切相關(guān)[17]。TNF-α 具有調(diào)控免疫應(yīng)答、促進(jìn)細(xì)胞生長分化等多種生物學(xué)功能,參與了多種炎癥反應(yīng)和神經(jīng)相關(guān)慢性疼痛[17]。白介素6 是一種多效性細(xì)胞因子,在免疫調(diào)節(jié)、再生過程、骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)保護(hù)等方面發(fā)揮多種生物學(xué)作用[18]。研究表明子宮內(nèi)膜異位癥患者血清TNF-α、IL-6 水平顯著升高且嚴(yán)重痛經(jīng)患者較無痛經(jīng)患者血清TNF-α、IL-6 顯著升高[19]。本研究中,模型組子宮組織TNF-α、IL-6 含量增高,陽性藥組、四物合劑組子宮組織TNF-α、IL-6 含量降低,表明四物合劑可能通過降低TNF-α、IL-6 減輕痛經(jīng)癥狀。

環(huán)氧化酶(COX)是參與PGs 的生物合成限速酶,臨床常用非甾體類抗炎藥治療原發(fā)性痛經(jīng),其機(jī)制主要是通過抑制COX 減少PGs 的生成,COX-2高表達(dá)使PGF2α升高加重痛經(jīng)[20]。本研究表明,四物合劑可降低COX-2 表達(dá),其治療痛經(jīng)機(jī)制可能與降低COX-2 表達(dá)從而抑制PGF2α治療小鼠原發(fā)性痛經(jīng)有關(guān)。

綜上所述,四物合劑能顯著減少原發(fā)性痛經(jīng)小鼠30 min 扭體次數(shù),延長扭體潛伏期,其作用機(jī)制可能與降低血清MDA 含量、子宮組織中PGF2α、IL-6、TNF-α 水平以及COX-2 表達(dá),改善組織病理學(xué)變化有關(guān),其機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。