趙家圓，高紹金，李艷青，韓齊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

肉制品在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)生一系列生物化學(xué)變化。原料肉通過(guò)有益微生物的作用，如乳酸菌、酵母菌等，可以改善產(chǎn)品質(zhì)地，提高食品安全性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的吸收率[1,2]，最終使發(fā)酵肉制品具有高營(yíng)養(yǎng)、高品質(zhì)、風(fēng)味獨(dú)特和貯存期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。

酵母菌是一種單細(xì)胞真核微生物，在傳統(tǒng)發(fā)酵制品中，魯氏酵母菌廣泛存在于豆醬、醬油等釀造產(chǎn)品中，也是在釀造過(guò)程中影響風(fēng)味品質(zhì)的重要微生物[3,4]。魯氏酵母菌經(jīng)降解產(chǎn)生大量糖類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并伴隨產(chǎn)生高級(jí)醇、芳香雜醇類和呋喃酮類化合物，為發(fā)酵肉制品提供增香作用。有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌還具有抗氧化活性，能夠保護(hù)肝臟[5]。酵母菌中的微量元素還具有抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防癌癥、提高人體免疫力的作用[6]。酵母菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)酸能力弱，不具備還原硝酸鹽的能力，能夠降低肉中微生物菌群的硝酸鹽還原能力。

植物乳桿菌是一種廣泛存在于發(fā)酵產(chǎn)品中的可食用微生物，其具有較高的安全性和功能性[7]。目前，植物乳桿菌生理功能的研究已有較多報(bào)道，在降低膽固醇、抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性、抑制食源性病原菌等方面均有較好的能力[8-11]。本試驗(yàn)所采用的魯氏酵母菌和植物乳桿菌在前期試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的發(fā)酵性能，并且對(duì)發(fā)酵肉制品的風(fēng)味改善有一定的積極作用，前期試驗(yàn)中已經(jīng)證明了魯氏酵母菌和植物乳桿菌的安全性[12]。因此，本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例為變量，以pH值和菌落總數(shù)為響應(yīng)值，優(yōu)化魯氏酵母菌和植物乳桿菌復(fù)配發(fā)酵劑的制備工藝條件，以用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii，保藏編號(hào)CICC32899)：購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：分離自發(fā)酵風(fēng)干腸，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1 FD型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DELTA-320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LDZX-50 KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將魯氏酵母菌及植物乳桿菌分別接種于YPD液體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中。魯氏酵母菌于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)(180 r/min)30 h，以2.0%的接種量傳代2～3次至活力恢復(fù)，魯氏酵母菌數(shù)至108CFU/mL備用。植物乳桿菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，以2.0%的接種量傳代2～3次至活力恢復(fù)，植物乳桿菌菌數(shù)至108CFU/mL備用。

1.3.2 拮抗試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，將植物乳桿菌劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(32 ℃，24 h)，將魯氏酵母菌垂直交叉魯氏酵母菌劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃，72 h)。觀察垂直交叉處是否有抑菌區(qū)域或菌落萎縮現(xiàn)象的產(chǎn)生。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)溫度的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度分別為20，22，25，28，30 ℃，檢測(cè)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)的變化。

培養(yǎng)時(shí)間的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中于22 ℃條件下分別培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，檢測(cè)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)的變化。

復(fù)配比的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種總量為2%。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(22 ℃，24 h)，檢測(cè)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)的變化。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化魯氏酵母菌與植物乳桿菌復(fù)配的最佳培養(yǎng)條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)和復(fù)配比(C)為變量，以pH值(Y1)和菌落總數(shù)(Y2)分別為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，最終分析確定魯氏酵母菌與植物乳桿菌復(fù)配的最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.5 pH值的測(cè)定

1.3.6 菌落總數(shù)的測(cè)定

根據(jù)GB 4789.2-2016菌落總數(shù)測(cè)定方法，取1 mL發(fā)酵液加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋，選取適宜的3個(gè)梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，待培養(yǎng)基凝固后于恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)算菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每組3個(gè)平行，數(shù)據(jù)均表示成Mean±SD，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，回歸方程方差分析顯著性檢驗(yàn)。采用Statistix 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 拮抗試驗(yàn)

圖1 魯氏酵母菌與植物乳桿菌的拮抗試驗(yàn)

本試驗(yàn)所采用的植物乳桿菌分離自傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)干腸，魯氏酵母菌在前期試驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出了良好的呈香作用，二者的添加有助于改善發(fā)酵肉制品的品質(zhì)，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成。在前期試驗(yàn)中對(duì)植物乳桿菌及魯氏酵母菌的安全性能及發(fā)酵性能進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果表明二者安全性較高，且具有良好的發(fā)酵性能，可以應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)中。將兩種不同的微生物發(fā)酵劑復(fù)配用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的前提使二者能夠共存，本研究對(duì)魯氏酵母菌及植物乳桿菌進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)。由圖1可知，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，魯氏酵母菌及植物乳桿菌菌落生長(zhǎng)良好，交叉處沒(méi)有明顯的抑制現(xiàn)象或菌落萎縮，說(shuō)明所用魯氏酵母菌與植物乳桿菌間無(wú)拮抗作用，可以用于后期復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度的影響

將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別于20，22，25，28，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)。由圖2可知，發(fā)酵液pH值呈先降低后升高的趨勢(shì)，菌落總數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)。在22 ℃培養(yǎng)溫度下，發(fā)酵液pH值最低，這是因?yàn)長(zhǎng).plantarum在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)繁殖生成乳酸等有機(jī)酸導(dǎo)致的[13]，而菌落總數(shù)最高，說(shuō)明22 ℃條件下Z.rouxii和L.plantarum的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且L.plantarum的產(chǎn)酸能力并沒(méi)有受到限制，較低的pH值有助于促進(jìn)發(fā)酵肉制品的成熟，抑制有害微生物的生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)溫度升高至25 ℃，發(fā)酵液pH值升高，菌落總數(shù)降低，這可能是由于培養(yǎng)溫度接近Z.rouxii的最適生長(zhǎng)溫度(28 ℃)，Z.rouxii開始快速生長(zhǎng)繁殖從而導(dǎo)致發(fā)酵液pH值升高。當(dāng)培養(yǎng)溫度升高至30 ℃時(shí)，pH值快速升高，菌落總數(shù)趨于平衡，這可能是由于前期Z.rouxii的大量生長(zhǎng)繁殖抑制了L.plantarum的生長(zhǎng)。因此，當(dāng)培養(yǎng)溫度在20～25 ℃范圍內(nèi)，Z.rouxii和L.plantarum的生長(zhǎng)繁殖不受到抑制，確定Z.rouxii和L.plantarum復(fù)配發(fā)酵液的最優(yōu)培養(yǎng)溫度為22 ℃。

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間的影響

Research on establishment of medical &nursing organizations for the elderly in Qingdao

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液pH值及菌落總數(shù)的影響

將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于22 ℃條件下分別恒溫培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在12～24 h范圍內(nèi)，pH值輕微下降，菌落總數(shù)升高，這可能是由于L.plantarum生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生有機(jī)酸導(dǎo)致的，并且Z.rouxii也具有較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)至36 h時(shí)，pH值快速升高，而菌落總數(shù)快速降低，說(shuō)明Z.rouxii的生長(zhǎng)繁殖速度超過(guò)了L.plantarum，開始抑制L.plantarum的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，pH值和菌落總數(shù)均呈升高趨勢(shì)，這可能是由于此時(shí)L.plantarum的生長(zhǎng)繁殖已經(jīng)進(jìn)入了衰亡期，而Z.rouxii的生長(zhǎng)繁殖尚未結(jié)束成為優(yōu)勢(shì)菌群導(dǎo)致的。因此，24 h為Z.rouxii和L.plantarum的最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.3 復(fù)配比例的影響

圖4 復(fù)配比例對(duì)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)的影響

將Z.rouxii和L.plantarum分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種總量為1%，22 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)發(fā)酵液的pH值及菌落總數(shù)的變化。由圖4可知，當(dāng)Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配比例由3∶1降低至2∶1時(shí)，發(fā)酵液的pH值升高，但菌落總數(shù)增加并不顯著(P>0.05)，說(shuō)明Z.rouxii的生長(zhǎng)繁殖情況優(yōu)于L.plantarum，Z.rouxii是優(yōu)勢(shì)菌群。當(dāng)Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配比例為1∶1時(shí)，pH值顯著降低(P<0.05)，菌落總數(shù)輕微升高，說(shuō)明當(dāng)Z.rouxii和L.plantarum復(fù)配比例為1∶1時(shí)，二者均能穩(wěn)定生長(zhǎng)，無(wú)抑制作用。當(dāng)Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配比例變至1∶2和1∶3時(shí)，pH值顯著降低(P<0.05)，菌落總數(shù)先降低后升高，這可能是由于L.plantarum的添加比例上升后大量生成有機(jī)酸造成pH值降低，從而抑制了Z.rouxii的生長(zhǎng)，菌落總數(shù)降低。繼續(xù)增加L.plantarum的添加比例后，L.plantarum成為優(yōu)勢(shì)菌群，開始快速生長(zhǎng)繁殖，菌落總數(shù)增加。最終確定Z.rouxii和L.plantarum的最優(yōu)復(fù)配比例為1∶1。

2.3 以pH值為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)和復(fù)配比例(C)為變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理，以發(fā)酵液pH值為響應(yīng)值，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù) 表

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得二次多元回歸方程：Y1=7.09-0.11A-0.064B+0.029C-0.038AB+0.028AC-0.17BC+0.048A2-0.08B2-0.11C2。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，分析回歸方程的擬合度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸方程方差分析表

模型的P<0.0001，說(shuō)明擬合所得二次多元回歸方程達(dá)到了極顯著水平，并且方程的擬合程度較好，失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，可以準(zhǔn)確地分析和預(yù)測(cè)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例等因素與發(fā)酵液pH值間的關(guān)系。模型R2=0.9905，說(shuō)明該模型擬合程度較好，可以利用該模型分析和預(yù)測(cè)Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配條件。所得二次多元回歸方程一次項(xiàng)A，B，交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)C2對(duì)發(fā)酵液pH值的影響極顯著，一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB、AC，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)發(fā)酵液pH值的影響顯著。由F值可知各因素對(duì)發(fā)酵液pH值影響的大小順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度(A)>培養(yǎng)時(shí)間(B)>復(fù)配比例(C)。

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸模型，對(duì)培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)和復(fù)配比例(C)3個(gè)因素兩兩對(duì)發(fā)酵液pH值作響應(yīng)面圖和等高線圖，見(jiàn)圖5。

圖5 不同因素交互作用對(duì)發(fā)酵液pH值的影響

由圖5可知，不同因素間交互作用對(duì)發(fā)酵液pH值的影響可以通過(guò)響應(yīng)面的變化及等高線的密集程度直觀地反映出來(lái)，當(dāng)響應(yīng)面圖呈馬鞍或橢圓形時(shí)，說(shuō)明兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著[14,15]。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例3個(gè)因素兩兩對(duì)發(fā)酵液pH值影響所得響應(yīng)面圖均為馬鞍形，說(shuō)明3個(gè)因素兩兩交互作用顯著。根據(jù)等高線的密集程度，培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液pH值影響的等高線較密集，說(shuō)明培養(yǎng)溫度的影響更為顯著，與回歸方程方差分析結(jié)果基本一致。

2.4 以菌落總數(shù)為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)和復(fù)配比例(C)為變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理，以發(fā)酵液菌落總數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù) 表

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得二次多元回歸方程：Y2=11.37-0.068A-0.013B-0.014C-0.019AB-0.028AC-0.084BC-0.048A2-0.047B2-0.066C2。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，分析回歸方程的擬合度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回歸方程方差分析表

模型的P<0.0001，說(shuō)明擬合所得二次多元回歸方程達(dá)到了極顯著水平，并且方程的擬合程度較好，失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，可以準(zhǔn)確地分析和預(yù)測(cè)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例等因素與發(fā)酵液菌落總數(shù)間的關(guān)系。模型R2=0.9865，說(shuō)明該模型擬合程度較好，可以利用該模型分析和預(yù)測(cè)Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配條件。所得二次多元回歸方程一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)C2對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)的影響極顯著，一次項(xiàng)B，C，交互項(xiàng)AB、AC，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)的影響顯著。由F值可知各因素對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)影響的大小順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度(A)>復(fù)配比例(C)>培養(yǎng)時(shí)間(B)。

2.4.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)回歸模型，對(duì)培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)和復(fù)配比例(C)3個(gè)因素兩兩對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)作響應(yīng)面圖和等高線圖，見(jiàn)圖6。

圖6 不同因素交互作用對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)的影響

由圖6可知，不同因素間交互作用對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)的影響可以通過(guò)響應(yīng)面的變化及等高線的密集程度直觀地反映出來(lái)。培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度與復(fù)配比例的響應(yīng)面圖為馬鞍形，培養(yǎng)時(shí)間與復(fù)配比例的響應(yīng)面圖接近橢圓形，說(shuō)明3個(gè)因素兩兩交互作用顯著。

2.5 回歸模型的驗(yàn)證結(jié)果

本研究選取發(fā)酵液pH值和菌落總數(shù)作為響應(yīng)值優(yōu)化Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配條件，響應(yīng)面分析結(jié)果也表明培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和復(fù)配比例均對(duì)發(fā)酵液pH值和菌落總數(shù)具有顯著影響，可以通過(guò)pH值和菌落總數(shù)的變化判斷Z.rouxii和L.plantarum間的生長(zhǎng)情況。但在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中不能僅以pH值作為Z.rouxii和L.plantarum生長(zhǎng)情況的判斷依據(jù)，必須與菌落總數(shù)指標(biāo)綜合考慮。因此，回歸模型的驗(yàn)證選取菌落總數(shù)作為最優(yōu)復(fù)配條件的判斷依據(jù)，最優(yōu)復(fù)配條件為培養(yǎng)溫度20.71 ℃，培養(yǎng)時(shí)間22.99 h，Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配比值為1.32，此時(shí)模型預(yù)測(cè)發(fā)酵液的菌落總數(shù)為11.39 lg CFU/mL。對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際結(jié)果為10.72 lg CFU/mL，與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)94.12%，表明模型擬合度較好，可以用于優(yōu)化Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配條件。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例為變量，以pH值及菌落總數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)和方差分析，結(jié)果顯示:兩組試驗(yàn)的預(yù)測(cè)模型均極顯著(P<0.01)，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和復(fù)配比例間兩兩交互作用均顯著，對(duì)發(fā)酵液pH值影響因素排序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>復(fù)配比例，對(duì)發(fā)酵液菌落總數(shù)影響的大小順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度>復(fù)配比例>培養(yǎng)時(shí)間。以菌落總數(shù)優(yōu)化復(fù)配條件為培養(yǎng)溫度20.71 ℃、培養(yǎng)時(shí)間22.99 h、Z.rouxii和L.plantarum的復(fù)配比值為1.32。對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)94.12%。