姬 慧，馮廣朋，黃曉榮，耿 智，莊 平

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海長江口漁業(yè)資源增殖和生態(tài)修復工程技術研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 200090)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)隸屬于甲殼綱絨螯蟹屬，是一種具有洄游習性的水生經濟物種，主要在長江流域等淡水水域棲息生長，性成熟后洄游到長江河口淺海水域完成交配產卵。由于環(huán)境污染、生境破壞、過度捕撈等原因，上世紀八十年代后中華絨螯蟹天然資源急劇衰退[1]。為了滿足群眾餐飲需要，九十年代以后中華絨螯蟹人工繁殖和池塘養(yǎng)殖逐步興起，目前我國中華絨螯蟹養(yǎng)殖產量已達4×105t。繁殖期是動物延續(xù)種群的重要生活史階段，產卵活動不僅對動物自身的能量需求較高，而且對其代謝生理亦有顯著影響。能量代謝是機體供能的根本途徑，相關酶活力降低以及代謝中間產物的缺失將阻斷新陳代謝通路，從而對生物體能量的供應造成影響。因此，能量代謝酶可在一定程度上反映動物體內的能量代謝水平[2]。

目前有關中華絨螯蟹繁殖期的研究主要集中在營養(yǎng)品質[3]、遺傳育種[4]、產卵場分布[5]、食性[6]、增殖放流[7,8]等方面，而對繁殖期中華絨螯蟹能量代謝酶調節(jié)的研究較少。本研究以中華絨螯蟹天然群體和養(yǎng)殖群體為實驗對象，測定分析了抱卵前后中華絨螯蟹的性腺、肝胰腺、肌肉等組織中能量代謝酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脫氫酶(PK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、精氨酸激酶(AK)]活力的變化，旨在為探討中華絨螯蟹繁殖期能量代謝調節(jié)機制、提升人工養(yǎng)殖技術、促進天然種群資源保護等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹天然群體抱卵前雌蟹采自江蘇鎮(zhèn)江長江干流水域(32.11°N，119.27°E，淡水)，抱卵后雌蟹采自長江口橫沙淺灘水域(31.23°N，121.57°E，鹽度為15)；養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹來自于江蘇省太湖水域(淡水)，抱卵后雌蟹來自于江蘇省南通市人工繁殖群體(鹽度為16)。抱卵前雌蟹和抱卵后雌蟹的采集時間分別為2018年11月和2019年1月。

養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹平均體重為(100.43±8.64) g，平均殼長為(54.63±1.31) mm，平均殼寬為(60.25±1.29) mm；抱卵后雌蟹(受精卵期)平均體重為(116.18±7.21) g,平均殼長為(55.38±1.41) mm，平均殼寬為(61.87±2.10) mm。天然群體抱卵前雌蟹平均體重為(60.91±17.95) g，平均殼長為(47.45±5.08) mm，平均殼寬為(52.45±5.45) mm；抱卵后雌蟹平均體重為(113.88±14.29) g，平均殼長為(55.20±2.25) mm，平均殼寬為(61.40±2.36) mm。

1.2 樣品采集和測定

每個實驗組選出體重相近、個體健壯、附肢完整的個體各15只。在冰盤上對每只蟹進行解剖，分別取出肝胰腺、肌肉、性腺等組織，迅速放入液氮中進行冷凍，再放入-80 ℃冰箱保存待測。酶活性測定前取出肝胰腺、肌肉和性腺組織，每個組織分別測定HK、PFK、PK、SDH、MDH、AK等6種酶的活性，酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測定方法按照試劑盒操作步驟進行，抱卵前雌蟹測定的試劑盒批號均為20190112，抱卵后雌蟹測定的試劑盒批號均為20190215。

取剪碎的組織樣品約0.2 g，將其放入玻璃勻漿管中，首先加入1.8 mL 0.90%的生理鹽水，利用勻漿機進行勻漿；然后用Allegra X-22R型冷凍離心機3000 r/min離心10 min；最后稀釋到10%組織勻漿進行測定。HK、PK、PFK、MDH、SDH等酶活力測定使用UNICO-UV2000分光光度計，選用340 nm波長，采用0.5 cm光徑石英比色皿；AK活力測定采用鉍鉬磷三元雜多酸體系定磷法。酶活性測定時使用華東電子DG5033A酶標儀，選用450 nm波長。總蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 MS Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 18.0軟件的配對樣本T檢驗和獨立樣本T檢驗及單因素方差分析(one-way ANOVA)，分析養(yǎng)殖群體和天然群體抱卵前后中華絨螯蟹各個組織中不同酶活性的差異顯著性，差異顯著性用P<0.05表示。

2 結果與分析

2.1 抱卵前后雌蟹糖酵解酶活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺和肌肉組織中HK活性顯著高于抱卵后。抱卵前后肝胰腺和肌肉組織中PFK活性無顯著差異。雌蟹抱卵前肝胰腺組織中PK活性顯著高于抱卵后，而抱卵前肌肉組織中PK活性顯著低于抱卵后。在性腺組織中，野生群體抱卵前HK活性(7.30±30.06 U/mg)顯著高于養(yǎng)殖群體(1.89±0.35 U/mg)，但野生群體抱卵前PFK和PK活性均顯著低于養(yǎng)殖群體(表1)。

表1 天然和養(yǎng)殖群體糖酵解酶活性的變化Tab.1 Changes of glycolytic enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.2 抱卵前后雌蟹三羧酸循環(huán)酶活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺組織中SDH活性高于抱卵后，但差異不顯著；抱卵前肌肉組織中SDH活性顯著高于抱卵后。雌蟹抱卵前肝胰腺組織中MDH活性顯著高于抱卵后，而抱卵后肌肉組織中MDH活性顯著高于抱卵前。在性腺組織中，養(yǎng)殖群體抱卵前SDH與MDH活性顯著高于野生群體(表2)。

表2 天然和養(yǎng)殖群體三羧酸循環(huán)酶活性的變化Tab.2 Changes of tricarboxylic acid cycle enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.3 抱卵前后雌蟹AK活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺組織中AK活性顯著高于抱卵后，而抱卵后肌肉組織中AK活性顯著高于抱卵前。在性腺組織中，養(yǎng)殖群體抱卵前AK活性(0.14±0.01) U/mg,顯著高于養(yǎng)殖群體(0.12±0.01) U/mg(表3)。

表3 天然和養(yǎng)殖群體精氨酸激酶活性的變化Tab.3 Changes of the arginine kinase activity of wild-caught and pond-reared populations

3 討論

3.1 糖酵解酶活性抱卵前后的差異

糖酵解途徑的主要限速酶是HK、PFK和PK，其中HK催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖[9]，PFK是衡量碳水化合物利用的重要代謝酶[10]，PK在糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP[11]。本研究中華絨螯蟹天然群體肝胰腺和肌肉組織中，抱卵前雌蟹HK活性顯著高于抱卵蟹，而抱卵前后PFK活性無顯著差異，表明抱卵前雌蟹比抱卵后利用葡萄糖的能力更強。中華絨螯蟹在長江口洄游過程中，需要適應河口水域鹽度的變化。雌蟹在抱卵前通過促進體內葡萄糖代謝，可以為維持體內滲透壓的平衡提供充足能量[12]。而當雌蟹抱卵后，處于等滲點狀態(tài)時用于維持滲透壓平衡的能量會相對較少，體內的酶活性會相應降低[13]。肝胰腺和肌肉是甲殼動物儲存肝糖原和肌糖原的重要組織[14-16]。本研究中天然群體抱卵前雌蟹肝胰腺組織中PK活性顯著高于抱卵蟹，而肌肉中PK活性與肝胰腺相反，表明抱卵前雌蟹以肝胰腺中糖酵解產生的能量供能，而抱卵后肌肉組織中糖酵解產生的能量供給增加。原因是抱卵后雌蟹使用螯足在腹部卵粒周圍持續(xù)撥動水流，有利于胚胎快速發(fā)育[17]，從而導致肌肉中PK活性高于抱卵前雌蟹。本研究亦表明，養(yǎng)殖群體雌蟹抱卵前后肌肉中PK活性的變化規(guī)律與天然群體結果一致，兩個群體存在同樣的變化規(guī)律。

3.2 三羧酸循環(huán)酶活性抱卵前后的差異

SDH和MDH是三羧酸循環(huán)途徑中調控脫氫反應的關鍵酶[18]，可在一定程度上反映水生生物的有氧代謝水平[19]。本研究表明，天然群體雌蟹抱卵前肌肉SDH活性和肝胰腺MDH活性顯著大于抱卵后，表明抱卵前雌蟹肝胰腺組織有氧代謝比抱卵后更強，這可能是由于抱卵前雌蟹需要將體內積累的大量營養(yǎng)物質氧化分解，從而釋放充足能量用于產卵繁殖活動[20]。有研究亦表明，中華絨螯蟹雌性親蟹在生殖洄游過程中主要以脂肪作為供能物質，代謝率與能量消耗逐漸降低[21]。與肝胰腺組織不同，天然群體雌蟹抱卵后肌肉組織MDH活性顯著高于抱卵前，這是因為雌蟹抱卵后使用螯足在腹部卵粒周圍持續(xù)撥動水流，有利于胚胎發(fā)育，從而增強了肌肉的有氧代謝，使能量代謝水平升高。本研究結果表明，養(yǎng)殖群體雌蟹在抱卵前后的肝胰腺和肌肉的SDH與MDH活性變化趨勢與天然群體一致，這也說明了雌蟹抱卵前肝胰腺組織有氧代謝高于抱卵后，抱卵后肌肉組織有氧代謝高于抱卵前。

3.3 精氨酸激酶活性抱卵前后的差異

AK是無脊椎動物體內調節(jié)能量代謝的重要酶之一[22]，可為調節(jié)滲透壓平衡提供能量[23]。本研究中天然群體雌蟹抱卵前肝胰腺組織AK活性顯著高于抱卵后，這是因為抱卵前雌蟹生活在淡水水域，而抱卵后雌蟹生活在咸水水域，雌蟹在向長江口生殖洄游過程中，需要產生和提供更多能量來調節(jié)體內滲透壓平衡，這與Serrano等[24]和Kinsey等[25]關于藍蟹(Callinectessapidus)的研究結果一致；另一方面，天然群體抱卵蟹肌肉組織中AK活性顯著高于抱卵前雌蟹，是因為抱卵蟹在腹部胚胎快速發(fā)育時，需要加強螯足在胚胎周圍水流的撥動從而，增加了肌肉的能量消耗。Grieshaber等[26]研究表明，AK活性與肌肉細胞運動過程中的能量持續(xù)產生密切有關，雌蟹肌肉組織的持續(xù)運動，需要提高AK酶的活性促進新陳代謝和能量物質分解。本研究中，養(yǎng)殖群體雌蟹抱卵前后肌肉組織中AK活性與天然群體雌蟹的變化趨勢一致，兩個群體存在同樣的變化規(guī)律。

4 結論

在肝胰腺組織中，天然群體和養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹都通過提高糖酵解酶、三羧酸循環(huán)酶和精氨酸激酶活性，提升體內能量的供應水平，用于產卵繁殖等機體活動的需要；而在肌肉組織中，兩個群體抱卵后雌蟹都通過提高糖酵解酶、三羧酸循環(huán)酶和精氨酸激酶活性水平，用于胚胎孵化、撥動水流等機體活動的需要。兩個群體雌蟹抱卵前都通過促進葡萄糖的利用和增加能量的供應，來調節(jié)機體自身的滲透平衡。HK、PFK、PK、SDH、MDH和AK活性都呈現(xiàn)出組織差異性，在能量代謝中發(fā)揮特定作用。因此，在人工養(yǎng)殖和增殖放流中華絨螯蟹時，可增加優(yōu)質餌料供應，強化親蟹體內脂類、蛋白質[27,28]等積累，促進其性腺發(fā)育和提升增養(yǎng)殖綜合效益。