左佳鑫，李 佳，熊 屏

口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性程度高，易復(fù)發(fā)，是頭頸部腫瘤患者的死亡原因之一[1-2]，患者預(yù)后不良主要包括不能徹底去除腫瘤病灶和以手術(shù)為主的治療方式創(chuàng)傷極大兩個原因。納米醫(yī)學(xué)利用納米技術(shù)進(jìn)行診療，作為一種微創(chuàng)診療方法，對改善口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后具有重要臨床價值[3-6]。光熱治療是指利用光熱轉(zhuǎn)化劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能的一種治療方法[7]，是納米醫(yī)學(xué)在癌癥治療應(yīng)用中最成熟的一種治療方法。光熱轉(zhuǎn)化劑可以在病灶富集，在激光照射下局部溫度升高[8]，而正常組織在激光照射下升溫不明顯，達(dá)到殺傷腫瘤組織而減少副作用的目的。因而光熱轉(zhuǎn)化劑的選擇在光熱治療過程中尤為重要。常用的傳統(tǒng)有機(jī)光熱轉(zhuǎn)化包括幾種發(fā)光團(tuán)[9-11]，由于光穩(wěn)定性差[12]，亟需改進(jìn)或取代，因而二維納米片[13-14]、有機(jī)半導(dǎo)體[15]和其他無機(jī)金屬納米顆粒[12]等新型光熱轉(zhuǎn)化劑迅速發(fā)展。此外，光熱轉(zhuǎn)化劑主要是通過增強(qiáng)滲透與滯留(enhance penetration and retention，EPR)效應(yīng)被動靶向至腫瘤部位[16-17]，光熱轉(zhuǎn)化劑尺寸越小越有利于光熱轉(zhuǎn)化劑利用EPR效應(yīng)在腫瘤部位富集[18]。在這些光熱轉(zhuǎn)化材料中，CuS[19]和Fe3O4[20]作為成熟的光熱材料，其光熱治療效果已經(jīng)在除口腔鱗狀細(xì)胞癌外的多種癌癥的治療試驗中得到驗證，而超小型硫化銅納米顆粒(ultra-small Cu2-xS nanoparticles，Cu2-xS NPs)[21]和四氧化三鐵納米顆粒(Fe3O4nanoparticles，F(xiàn)e3O4NPs)由于尺寸小，光熱轉(zhuǎn)化效果好，制備簡單，具有更高的應(yīng)用價值，因此，Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs介導(dǎo)的光熱治療在口腔鱗狀細(xì)胞癌治療方面的應(yīng)用具有一定的研究價值。

綜上所述，為了解決口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療難題，促進(jìn)光熱治療的臨床轉(zhuǎn)化，我們提出探究和比較Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs介導(dǎo)的光熱治療在口腔鱗狀細(xì)胞癌體外實驗的治療效果，通過合成Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，比較兩者的光熱轉(zhuǎn)化性能、光熱穩(wěn)定性、生物相容性、腫瘤細(xì)胞殺傷效果，評估兩種光熱轉(zhuǎn)化劑體外治療口腔鱗狀細(xì)胞的效果，為體內(nèi)試驗提供實驗基礎(chǔ)，為光熱治療在口腔鱗狀細(xì)胞癌治療方面提供材料基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

硫粉(99.99%，阿拉丁，上海)，乙酰丙酮銅(98%，西格瑪，上海)，油胺(C18H37N，C18含量為80%～90%，西格瑪)，氯仿(分析純，上海凌峰化學(xué)有限公司)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG2000-COOH，上海芃碩生物科技有限公司)，乙酰丙酮鐵(98%，阿拉丁，上海)，油酸(C18H34O2，85%，阿拉丁，上海)；口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系OSC-19細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供)，細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)。

超聲清洗機(jī)，高速離心機(jī)，透射電鏡(JEM-2100F，日本電子株式會社)，無菌恒溫培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，近紅外激光器(波長為1 064 nm)，紅外相機(jī)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的制備 Cu2-xS NPs的合成過程如下：將硫粉加入油胺中，并置于70 ℃磁力攪拌水浴鍋中攪拌，當(dāng)溶液變?yōu)樽丶t色且無固體殘留時，將溶解在油胺和氯仿混合溶液的乙酰丙酮銅快速滴加到上述棕紅色溶液中，保持在70 ℃繼續(xù)攪拌，待溶液變?yōu)槟G色，說明有Cu2-xS NPs產(chǎn)生。 然后加入乙醇以終止反應(yīng)，通過高速離心收集產(chǎn)物，用乙醇、氯仿混合溶液洗滌3次，收集產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物與DSPE-PEG2000-COOH按照1∶5的質(zhì)量比溶解在氯仿中，然后在60 ℃下懸蒸1 h去除溶劑，加入去離子水超聲溶解，過濾即得到Cu2-xS NPs。

Fe3O4NPs的合成過程如下：將乙酰丙酮鐵、油胺和油酸的混合物置于三口燒瓶中，接空氣冷凝管，真空-氬氣循環(huán)3次。將混合溶液的溫度升高至120 ℃，攪拌溶解，保持2 h，隨后繼續(xù)升溫至220 ℃，保持30 min，最后將溶液溫度升高至300 ℃，維持30 min，反應(yīng)結(jié)束后，室溫冷卻至常溫，超聲收集產(chǎn)物，加入乙醇離心3次，收集產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物與DSPE-PEG2000-COOH按照1∶5的質(zhì)量比溶解在氯仿中，然后在60 ℃下懸蒸1 h去除溶劑，加入去離子水超聲溶解，過濾即得到Fe3O4NPs。

1.2.2 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光熱效應(yīng) 設(shè)置不同濃度(0(去離子水)、10、20、40和80 μg/mL)的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs水溶液，NIR激光下照射，用紅外熱像儀記錄NIR激光照射5 min內(nèi)的溫度變化。通過記錄Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的升溫-降溫循環(huán)探究二者的光熱穩(wěn)定性，在近紅外(near-infrared, NIR)激光(激光參數(shù)：波長為1 064 nm，脈沖功率為1.5 W/cm)照射5 min后關(guān)閉激光，使溶液溫度逐漸降至室溫(約5 min)為一個循環(huán)，即升溫-降溫循環(huán)，分別將濃度為40 μg/mL的Cu2-xS NP和Fe3O4NPs水溶液重復(fù)5個升溫-降溫循環(huán)，記錄溫度變化。

1.2.3 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs針對口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外治療 利用CCK-8法對光熱轉(zhuǎn)化劑的細(xì)胞毒性和體外光熱治療對OSC-19細(xì)胞活性的影響進(jìn)行評估。首先將OSC-19細(xì)胞接種到4塊96孔板中培養(yǎng)24 h貼壁。然后，分別用含有Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的培養(yǎng)基(Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的濃度：0、10、20、40、80和160 μg/mL)代替原始培養(yǎng)基。4塊96孔板繼續(xù)在無菌恒溫培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h和48 h。隨后，用CCK-8進(jìn)行染色，染色1.5 h后，在酶標(biāo)儀上測試吸光度(λ=450 nm)。然后將OSC-19細(xì)胞接種到2塊96孔板中培養(yǎng)24 h貼壁。然后，分別用含有Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的培養(yǎng)基(Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的濃度：0、10、20、40、80和160 μg/mL)代替原始培養(yǎng)基，其中材料濃度為0 μg/mL是對照組，用于空白對照不做處理。其他組用NIR激光(激光參數(shù)：波長為1 064 nm，脈沖功率為1.5 W/cm，照射時間為5 min)處理后，用CCK-8進(jìn)行染色，染色1.5 h后，在酶標(biāo)儀上測試吸光度(λ=450 nm)。細(xì)胞活性指標(biāo)用經(jīng)過處理后細(xì)胞吸光度相對于未經(jīng)過處理的對照組細(xì)胞吸光度的百分比表示。隨后，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察治療后細(xì)胞的凋亡情況。將OSC-19細(xì)胞接種到3個共聚焦皿上，在無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁，分為3組：對照組、Cu2-xS NPs組和Fe3O4NPs組，分別用1 mL新鮮培養(yǎng)液、含有Cu2-xS NPs(100 μg/mL)新鮮培養(yǎng)液和含有Fe3O4NPs(100 μg/mL)新鮮培養(yǎng)液替換原始培養(yǎng)液，用NIR激光(激光參數(shù)：波長為1 064 nm，脈沖功率為1.5 W/cm，照射時間為5 min)處理后，用鈣黃綠素-AM/PI染液染色觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計分析

定量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。根據(jù)收集數(shù)據(jù)類型，為比較Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs不同濃度對細(xì)胞活性的影響，數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的制備

合成的Cu2-xS NPs溶液為墨綠色，尺寸為5 nm左右(圖1a)；Fe3O4NPs為棕褐色，尺寸為10 nm左右(圖1b)。二者具有良好的穩(wěn)定性和親水性，可以在水溶液中均勻分散，有利于保存，并減少在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的團(tuán)聚。

a：Cu2-xS NPs；b：Fe3O4 NPs；比例尺為50 nm圖1 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的透射電鏡結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural characterizations of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs

2.2 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的光熱效應(yīng)

利用光熱相機(jī)監(jiān)控NIR激光照射光熱轉(zhuǎn)化劑引起的局部溫度升高(圖2a、b)和升溫-降溫循環(huán)穩(wěn)定性(圖3c、d)來評估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光熱效應(yīng)。局部溫度升高(圖2a、b)結(jié)果為：在NIR激光照射下，不同濃度的Cu2-xS NPs水溶液局部溫度升高5～30 ℃，濃度越低局部溫度上升幅度越小，濃度越高溫度上升幅度越大；不同濃度的Fe3O4NPs水溶液局部溫度升高4～15 ℃，溫度升高程度低于Cu2-xS NPs水溶液，最高濃度為80 μg/mL的Cu2-xS NPs水溶液局部溫度升高了30 ℃，而濃度為80 μg/mL的Fe3O4NPs水溶液局部溫度僅升高了30 ℃。此外，體外的升溫-降溫循環(huán)穩(wěn)定性(圖2c、d)結(jié)果為Cu2-xS NPs水溶液每次升高的最高溫度范圍為40～45 ℃，降低的最低溫度范圍為30～35 ℃，F(xiàn)e3O4NPs水溶液每次升高的最高溫度范圍為25～30 ℃，降低的最低溫度范圍為35～40 ℃。

2.3 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs針對口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外治療

為了評估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs針對口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外治療效果，我們將OSC-19細(xì)胞分別與Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs共孵育，以進(jìn)行體外探究。首先通過CCK-8法評估制備的光熱轉(zhuǎn)化劑Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的細(xì)胞毒性(圖3a、b)。結(jié)果顯示，不同濃度的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs在培養(yǎng)24 h和48 h后，細(xì)胞活性均大于90%，實驗數(shù)據(jù)分散，無法畫出擬合曲線且經(jīng)過相關(guān)性分析(圖3c)，同一材料，按照不同濃度與細(xì)胞共孵育相同時間，各組P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。

Cu2-xS NPs(a)和Fe3O4 NPs(b)的局部升溫曲線；激光開啟和關(guān)閉5個循環(huán)Cu2-xS NPs(c)和Fe3O4 NPs(d)升溫和降溫的光熱循環(huán)曲線圖2 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的光熱效應(yīng)探究Fig.2 Investigation of the photothermal performance of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs

隨后，評估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs對OSC-19細(xì)胞的治療效果(圖3d、e)。實驗結(jié)果顯示，在NIR激光照射后，與Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs共孵育的OSC-19細(xì)胞的活性隨著光熱轉(zhuǎn)化劑濃度的升高而逐漸降低，尤其光熱轉(zhuǎn)化劑最大濃度為160 μg/mL，經(jīng)過Cu2-xS NPs介導(dǎo)的光熱治療處理OSC-19細(xì)胞的活性降低至35.35%，而Fe3O4NPs介導(dǎo)的光熱治療處理OSC-19細(xì)胞的活性降低至50.76%，可以畫出擬合曲線(圖3f)，其擬合曲線的P(Cu2-xS NPs)=0.006，P(Fe3O4 NPs)=0.028，說明有統(tǒng)計學(xué)意義，其中R2分別為0.825 1(Cu2-xS NPs)和0.881 1(Fe3O4NPs)。CLSM(圖3g、h和i)也可以觀察到在光熱治療后，死細(xì)胞(紅色熒光)數(shù)量多于對照組。

a：Cu2-xS NPs的細(xì)胞毒性；b：Fe3O4 NPs的細(xì)胞毒性；c：細(xì)胞毒性實驗細(xì)胞活性與材料濃度的相關(guān)性；d：Cu2-xS NPs和(e) Fe3O4 NPs介導(dǎo)的體外光熱治療后，OSC-19細(xì)胞的細(xì)胞活性；f：體外細(xì)胞治療細(xì)胞活性與濃度的擬合曲線；CLSM下觀察對照組(g)、Cu2-xS NPs組(h)、Fe3O4 NPs組(i)的鈣黃綠素-AM / PI染液染色細(xì)胞凋亡情況；g,h和i的比例尺：100 nm圖3 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外實驗Fig.3 In vitro cellular experiment of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs against OSC-19 cells

3 討 論

根據(jù)圖4，利用熱解法可以大量合成Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs(圖4a)，并用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的體外光熱治療(圖4b)。這種方法不僅可以快速大量制備出光熱轉(zhuǎn)化劑Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，而且所制備的光熱轉(zhuǎn)化劑直徑小，穩(wěn)定性好，不僅可以單獨(dú)用于光熱治療，而且可以通過物理吸附或化學(xué)結(jié)合的方法，進(jìn)行不同材料的結(jié)合，以用于設(shè)計出多種協(xié)同治療方案。

a：Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的合成；b：不同材料針對口腔鱗狀細(xì)胞癌光熱治療的體外實驗圖4 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的合成和治療口腔鱗狀細(xì)胞癌體外實驗的示意圖Fig.4 Schematic diagram of the synthesis of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs in combat against oral squamous cell carcinoma in vitro

具有光熱轉(zhuǎn)化能力的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs能夠?qū)IR激光的光能轉(zhuǎn)化為熱量。本實驗通過局部溫度變化和升溫-降溫曲線分析，對Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光熱轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，光熱轉(zhuǎn)化劑硫化銅和四氧化三鐵的新構(gòu)型Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光熱轉(zhuǎn)化能力在分子水平存在差異，Cu2-xS NPs的光熱轉(zhuǎn)化能力在分子水平強(qiáng)于Fe3O4NPs。此外，與有機(jī)光熱轉(zhuǎn)化劑[12]相比，連續(xù)5個循環(huán)的加熱冷卻導(dǎo)致的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs溶液的升溫-降溫變化過程中，升溫-降溫曲線形態(tài)變化不大，表明雖然Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs光熱轉(zhuǎn)化能力有差異，但是作為無機(jī)光熱材料都具有良好的光熱穩(wěn)定性。

Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs對OSC-19細(xì)胞具有體外光熱治療作用。根據(jù)文獻(xiàn)報道[7]，細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示， 即使與OSC-19細(xì)胞共孵育的Cu2-xSNPs和Fe3O4NPs濃度高達(dá)160 μg/mL， 且共孵育時間長達(dá)48 h仍然沒有觀察到明顯的細(xì)胞毒性，同一材料的不同濃度和同一濃度的不同材料對細(xì)胞活性沒有影響，這表明所制備的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs具有良好的生物相容性，可以用于進(jìn)行后續(xù)的體外細(xì)胞實驗。Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs對OSC-19細(xì)胞的治療效果的評估，從擬合曲線可以看出，隨著材料濃度的升高兩種材料對細(xì)胞的殺傷效果明顯增強(qiáng)，Cu2-xS NPs對OSC-19細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于Fe3O4NPs；CLSM下可以直觀地觀察到光熱治療能殺死細(xì)胞，實驗組的細(xì)胞數(shù)量小于對照組，可能是由于細(xì)胞死亡不再能很好地貼在共聚焦皿表面，在染色過程中脫落。因此在選擇光熱治療的光熱轉(zhuǎn)化劑時，若考慮療效，Cu2-xS NPs比Fe3O4NPs更好，為多方案協(xié)同治療提供參考。

4 結(jié) 論

總而言之，我們通過熱解法合成小尺寸光熱轉(zhuǎn)化劑Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，通過對二者的升溫程度、光熱穩(wěn)定性、生物相容性以及針對OSC-19細(xì)胞的殺傷效果進(jìn)行評估比較，發(fā)現(xiàn)所制備的Cu2-xS NPs具有更好的光熱效應(yīng)，并且對OSC-19細(xì)胞的殺傷效果(細(xì)胞活性降低至35.35%)要強(qiáng)于Fe3O4NPs(細(xì)胞活性降低至50.76%)，為后續(xù)口腔鱗狀細(xì)胞癌的體內(nèi)光熱治療提供一個實驗依據(jù)，有利于后續(xù)光熱治療體內(nèi)試驗的進(jìn)行，并為光熱治療的臨床應(yīng)用提供一個良好的思路和光熱轉(zhuǎn)化劑的選擇。