李潤楠

（山東省博興縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心 山東濱州 256500）

鴨巴氏桿菌?。带喕魜y或鴨出血性敗血癥）是目前養(yǎng)鴨業(yè)中一種常見的、危害嚴重的細菌類疾病。該病是一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。其病原菌為禽多殺性巴氏桿菌，該菌可感染多種家禽（如雞、鴨、鵝等）和野鳥。鴨巴氏桿菌病具有發(fā)病急、死亡率高等特點，臨床上多表現(xiàn)腹瀉等癥狀，剖檢的主要特征為敗血癥病狀，通常表現(xiàn)肝臟顏色變淺，且其表面散布針尖大小灰白色的壞死點，十二指腸出血較為嚴重，心包積液等病理變化，通常發(fā)病率和死亡率均比較高。近年來隨著集約化、放牧式養(yǎng)鴨模式的快速發(fā)展，鴨巴氏桿菌病發(fā)病率呈上升趨勢，造成了嚴重的危害。鴨巴氏桿菌病在我國部分地區(qū)發(fā)病情況還是比較嚴重的，對養(yǎng)殖場造成了嚴重的經(jīng)濟損失，因此必須加強對該病的防控。本文總結(jié)了一例由鴨頭分離出的禽巴氏桿菌的鑒定，并進行了簡要的分析，以供參考。

1 發(fā)病情況

山東某養(yǎng)鴨場內(nèi)50～60 日齡的櫻桃谷肉雛鴨突然發(fā)病，大部分病鴨精神萎靡，羽毛松亂，尾翅下垂，腹瀉，排帶有少量血液的腥臭味稀糞，呈白色或黃綠色；嚴重病鴨兩腿酸軟，行動緩慢，或癱瘓在角落，不能走動；食欲廢絕，喝水欲增加，口鼻中有酸臭味的液體流出，呼吸困難，大口喘氣，頻繁搖頭，體溫升高，多在42～43℃。發(fā)病1d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，送診時已死亡100 羽左右。根據(jù)臨床表現(xiàn)初步診斷可能是禽巴氏桿菌病，但該養(yǎng)殖場前一段時間剛剛控制了一起鴨疫的疫情，因此不能排除鴨疫再次感染，需進一步檢測。

2 病理變化

對送檢的病死鴨進行剖檢，可見呼吸道黏膜充血和出血性炎癥，皮下組織、腹膜均有出血點，腸道黏膜有充血或呈現(xiàn)卡他性的炎癥，尤以前半段小腸最為嚴重，腸內(nèi)容物呈污紅色。肝臟腫大，有出血點和灰白色壞死點，呈墨綠色，心臟冠狀溝脂肪、心肌及心內(nèi)膜充血或出血，心包內(nèi)有橙黃色滲出液，膽囊腫大。無菌采集病死鴨肝臟、鴨頭等進行實驗室鑒定。

3 細菌分離培養(yǎng)

在生物安全柜內(nèi)將病死鴨的肝臟、腦等組織分別接種于麥康凱平皿和含4%犢牛血清的TSA 平皿，37℃培養(yǎng)24h 后觀察細菌的生長情況。結(jié)果麥康凱上均無菌落，在TSA 平皿上均出現(xiàn)圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的菌落，且菌落周圍不溶血；分別選取肝臟、鴨頭分離菌單菌落接種到含4%犢牛血清的TSA 平皿上進行純化培養(yǎng)，然后經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察菌體的大小、形態(tài)及結(jié)構(gòu)。結(jié)果肝臟和鴨頭中分離菌均為革蘭氏陰性小桿菌，單個或成對出現(xiàn)，呈卵圓形。

4 PCR 鑒定

用禽多殺性巴氏桿菌和鴨疫李默氏桿菌特異性基因引物進行PCR 鑒定。挑取單個疑似菌落于100μL 無菌的ddH2O 中，沸水中煮沸10min，10,000rpm 離心5min，取上清液作為PCR 模板。PCR 體系為：2× Taq PCR Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，補滅菌水至20μL，同時設(shè)立陰陽性對照，陽性對照分別選用巴氏桿菌和鴨疫李默氏桿菌標準株，反應(yīng)條件為95℃預變性5min，95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠板電泳后，凝膠板在凝膠成像儀成像分析，結(jié)果反應(yīng)條帶的大小與巴氏桿菌預期大小相符，鴨疫李默氏桿菌引物PCR 無條帶。由此可以確定該養(yǎng)鴨場只是多殺性巴氏桿菌病，并從鴨頭中也分出了多殺性巴氏桿菌病原體。

5 莢膜抗原血清型鑒定

為進一步確定分離株血清型，用多殺性巴氏桿菌分型引物進行PCR 擴增。PCR 體系為：2× Taq PCR Master Mix 10μL、引物各0.5μL、模板1μL，補滅菌水至20μL，反應(yīng)條件為95℃預變性5min，95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上出現(xiàn)1,000bp 左右的條帶，與A 型擴增目的片段大小一致，因此確定該分離株是莢膜血清A 型的多殺性巴氏桿菌。

6 藥敏試驗

選擇頭孢曲松、新霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、氨芐西林、恩諾沙星、多西環(huán)素、丁胺卡那、氟苯尼考、慶大霉素、紅霉素、頭孢噻肟、克林霉素、阿莫西林和多粘菌素B 共17 種藥敏片進行常規(guī)藥物耐藥性分析。將分離的多殺性巴氏桿菌均勻接種到兩個含4%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，再將各藥敏片均勻放到平板的合適位置，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h 后，觀察并測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，進而對藥物敏感性進行判定。結(jié)果顯示該分離菌對丁胺卡那、頭孢噻肟呈現(xiàn)中度敏感，對磺胺甲基異惡唑和多粘菌素B 低敏，其余藥物均耐藥。以上鑒定和藥敏結(jié)果已反饋給相關(guān)養(yǎng)殖場，該場通過敏感藥物治療5d 后，病情逐漸好轉(zhuǎn)，得到了有效控制。

7 討論

經(jīng)過對該養(yǎng)殖場內(nèi)鴨發(fā)病情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)場內(nèi)鴨舍、運動場地等活動空間狹窄，場內(nèi)設(shè)施相對簡陋，飼養(yǎng)管理水平較差，不久前剛剛發(fā)生一起鴨傳染性漿膜炎病情。此次疫情為急性發(fā)病，短期內(nèi)死亡較多，多數(shù)病鴨精神萎靡、呆立、行走無力、食欲廢絕，體溫上升，口鼻中流出酸臭味液體，呼吸困難，有的不斷甩頭等癥狀。結(jié)合飼養(yǎng)條件、衛(wèi)生管理、發(fā)病情況、臨床癥狀及病理變化等綜合分析初步診斷為巴氏桿菌感染，但不排除聯(lián)合感染鴨傳染性漿膜炎。通過實驗室細菌分離培養(yǎng)，并結(jié)合特異性的PCR 檢測，最終確定該養(yǎng)鴨場感染A 型多殺性巴氏桿菌病。按照多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的不同，被分為A、B、D、E 和F 型5 種血清型，且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護。對病原菌鑒定時，有必要明確分離菌的血清型，可為分子流行病學調(diào)查和疫苗候選菌株的選擇提供科學參考。當前我國禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型以A 型為主。本次分離除肝臟組織分出了多殺性巴氏桿菌病原外，在鴨頭中也分出了多殺性巴氏桿菌病原。

鴨巴氏桿菌感染是當前養(yǎng)鴨業(yè)中最常見的一種傳染病，雛鴨高度易感，且5 周齡以下的雛鴨死亡率較高。該病病原為條件性致病菌，在惡劣的環(huán)境條件或出現(xiàn)并發(fā)病時，鴨群發(fā)病率升高，死亡率增大。近幾年，禽巴氏桿菌病一般呈地方性流行或者散發(fā)，常與其他疾病混合性感染。在實際養(yǎng)殖中禽巴氏桿菌疾病的防控，不能單純的依靠應(yīng)用抗生素藥物，還應(yīng)提高養(yǎng)殖場獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度的科學執(zhí)行力。同時要加強日常飼養(yǎng)管理，搞好養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生、定期消毒，尤其要消滅老鼠、禁止貓狗等動物與禽群的接觸，從源頭上切斷傳染源，是控制該病發(fā)生、擴散蔓延的重要防治手段。本研究選擇了臨床上應(yīng)用的17 種抗生素對分離的鴨巴氏桿菌進行了藥物敏感試驗，試驗結(jié)果表明，該鴨場的禽巴氏桿菌除對丁胺卡那、頭孢噻肟、磺胺甲基異惡唑和多粘菌素B 四種藥物呈現(xiàn)出不同程度的敏感外，對其他的13 種抗生素均表現(xiàn)耐藥性，尤其對臨床常用藥物磺胺甲基異惡唑等表現(xiàn)出了高度耐藥性，這說明該養(yǎng)殖場的藥物耐藥情況非常嚴重，這與其日常養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用有很大關(guān)系。耐藥性的嚴重為臨床上治療鴨巴氏桿菌病及其他細菌性疾病帶來很大困難，因此在實際養(yǎng)殖工作中一定要合理用藥，減少抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

鴨巴氏桿菌病臨床上常呈現(xiàn)急性敗血癥過程，急性型發(fā)病率和死亡率可高達90%，該病呈世界性分布，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細菌性傳染病之一，給我國的禽類養(yǎng)殖市場帶來了巨大的損失和隱患。目前合理開展全價細菌滅活疫苗的免疫接種能夠有較好的保護效果。同時利用流行菌株制備自家滅活苗也可以起到很好的預防效果。