顧全，柳朔怡，韓素桂，張尊，孫尚凡，張玉敏(1.唐山市人民醫(yī)院 a.檢驗科，b.核醫(yī)學檢驗科，c.輸血科，河北唐山 06000；.唐山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷遺傳病診斷中心，河北唐山 06000；.唐山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，河北唐山 06000)

諾卡菌屬是一類嚴格需氧菌，革蘭染色呈陽性或不定，有弱抗酸性。其分類隸屬于放線菌綱、放線菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科，目前已知該屬有效命名菌種有111個，常見致病菌種有膿腫諾卡菌(N.abscessus)、皮疽諾卡菌(N.farcinica)、巴西諾卡菌(N.brasiliensis)等。圣喬治教堂諾卡菌(N.Cyriacigeorgica)是2001年命名的諾卡菌種，但非新發(fā)致病菌[1]。在確定獨立分類位置之前多被鑒定為“星形諾卡菌(N.asteroides)”藥物Ⅵ型。2005年Conville等通過16S rRNA基因、hsp65基因和DNA-DNA雜交等分類證據(jù)證實星形諾卡菌藥物Ⅵ型應鑒定為圣喬治教堂諾卡菌[2]。目前圣喬治教堂諾卡菌是日本、泰國和我國臺灣地區(qū)諾卡菌病的主要致病菌種[3]，并在近年來我國大陸地區(qū)報告比率逐漸上升，部分地區(qū)可達46%[4]。按《臨床微生物手冊》(第11版)報道，圣喬治教堂諾卡菌可能是常見的人類諾卡菌病原體，之前報道的星形諾卡菌大部分是該種[5]。隨著分子鑒定技術的發(fā)展，過去鑒定為“星形諾卡菌”或“星形諾卡菌復合群”菌株多被證實為其他已命名菌種，嚴格意義的星形諾卡菌已少有致病報道[5]。本研究對2株諾卡菌臨床分離株進行表型與基因鑒定，并對臨床常用抗菌藥物進行體外藥敏試驗，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源與初步鑒定 收集2019年唐山市人民醫(yī)院臨床分離諾卡菌菌株2株。其中A30分離自呼吸科患者支氣管灌洗液標本，A151分離自婦科患者痰標本。經(jīng)革蘭染色和弱抗酸染色鏡下觀察形態(tài)，初步鑒定至諾卡菌屬。

1.2主要儀器及試劑 SLAN基因擴增儀(上海宏石公司)，ABI 3730型DNA測序儀(美國ABI公司)；2×Taq PCR Mix擴增體系(上海生工公司)，血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力平板、麥康凱平板(鄭州安圖公司)，藥敏紙片與E-test藥敏試條(溫州康泰公司)，快速革蘭染色液、快速抗酸染色液(珠海貝索公司)，引物合成與擴增產(chǎn)物測序由上海生工公司完成。

1.3形態(tài)學鑒定 菌株分別接種血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落形態(tài)。革蘭染色按試劑說明書進行操作；弱抗酸染色參考快速抗酸染色試劑說明書略作改動：石炭酸復紅溶液染色15 min，0.2 mol/L硫酸溶液脫色3 min，亞甲基藍溶液染色1 min。

1.4基因擴增、測序與鑒定 用水煮裂解法提取DNA[6]。參照文獻[7-8]合成原核生物16S rRNA基因通用引物8F、1492R和hsp65基因引物，并參照文獻反應條件進行。引物與擴增信息見表1。用2×Taq PCR Mix預混液配制體系。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，交由上海生工公司進行產(chǎn)物純化并在ABI 3730型DNA測序儀上行Sanger雙向測序。測序結果截去引物結合區(qū)并選取QV值>25的片段，以Blast比對搜索GenBank數(shù)據(jù)庫。以MEGA 5.0軟件構建16S rRNA基因與hsp65基因系統(tǒng)進化樹，用鄰接法與Kimura兩參數(shù)模型，進化樹拓撲枝以Bootstrap法自舉檢驗1 000次。龜分枝桿菌作為系統(tǒng)進化樹外枝。

表1 基因擴增所用引物信息

1.5藥敏分析 用E-test方法測定最低抑菌濃度(MIC)[9]，測試藥物包括阿米卡星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、妥布霉素、頭孢吡肟、慶大霉素。35 ℃培養(yǎng)48 h后讀取MIC值，若生長不足，培養(yǎng)時間延至72 h。參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M24-A2標準判讀結果[10]。用E-test法、微量肉湯稀釋法和紙片擴散法對甲氧嘧啶/磺胺甲噁唑藥敏結果進行驗證，35 ℃培養(yǎng)48 h，若生長不足延至72 h。復方磺胺甲噁唑MIC值≤2 μg/mL/38 μg/mL為敏感，≥4 μg/mL/76 μg/mL為耐藥。紙片擴散法中，抑菌圈直徑≥35 mm判為敏感，≤15 mm判為耐藥。微量肉湯稀釋法中，菌體生長量80%被抑制判為終點孔。

2 結果

2.1菌株形態(tài)學鑒定 圣喬治教堂諾卡菌可在血平板、巧克力平板上緩慢生長，培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)小的顆粒樣菌落，培養(yǎng)72 h后呈淡黃色、干燥、堆積樣菌落，有泥土氣味，麥康凱平板未見生長。革蘭染色陽性，菌體可部分脫色呈串珠狀。有弱抗酸性，可抵抗0.2 mol/L硫酸溶液脫色，臨床標本中菌體呈分枝狀,可相互纏繞，見圖1。

注：A，圣喬治教堂諾卡菌血平板培養(yǎng)72 h生長菌落；B，痰標本中圣喬治教堂諾卡菌弱抗酸染色形態(tài)(×1 000)；C，圣喬治教堂諾卡菌血瓊脂平板培養(yǎng)72 h革蘭染色形態(tài)(×1 000)。

2.2基因鑒定與進化分析 A30和A151 16S rRNA基因與圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica，登錄號：NR041857.1)相似度分別為99.92%和100%，與少食諾卡菌(N.paucivorans，登錄號：NR041863.1)相似度為98.83%和98.59%，與星形諾卡菌(N.asteroides，登錄號：NR041856.1)相似度為98.46%和95.53%。2株臨床分離株可鑒定為圣喬治教堂諾卡菌，測序生物信息學數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)2次雙向測序，發(fā)現(xiàn)A30菌種在16S rRNA基因48位為簡并堿基R(A/G)，可能是該菌存在多拷貝的16S rRNA基因，見圖2。A30和A151hsp65基因與圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica，登錄號：AY756522.1)相似度均為100%，與其他諾卡菌種相似度低于98.6%。16S rRNA基因與hsp65基因的系統(tǒng)進化樹顯示，A30與A151均與圣喬治教堂諾卡菌DDSM 44484在同一拓撲分枝，與其他諾卡菌種有較大進化距離。見圖3、圖4。

表2 2株諾卡菌測序生物信息學分析數(shù)據(jù)

圖2 圣喬治教堂諾卡菌A30菌株16S rRNA基因多拷貝位點

注：以龜分枝桿菌(M. chelonae)AY457072.1為根。

注：以龜分枝桿菌(M. chelonae)JX154110.1為根。

2.3藥敏試驗結果 2株圣喬治教堂諾卡菌對阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、妥布霉素、頭孢吡肟、復方磺胺甲噁唑均敏感，對環(huán)丙沙星耐藥。紙片擴散法顯示，A30和A151菌株復方磺胺甲噁唑抑菌圈直徑分為38 mm和19 mm。E-test法和微量肉湯稀釋法確定復方磺胺甲噁唑MIC值分別為0.125 μg/mL/2.375 μg/mL和0.5 μg/mL/9.5 μg/mL。見表3。

表3 2株圣喬治教堂諾卡菌抗菌藥物敏感性結果

3 討論

圣喬治教堂諾卡菌的中文翻譯尚有分歧，部分學者引用“蓋爾森基興諾卡菌”翻譯。2019年國際系統(tǒng)與進化微生物學期刊《International Journal of Systematics of Evolutionary Microbiology》更新了《國際原核生物分類命名法》，原核生物命名有明確的詞源，中文翻譯可參考詞源。“cyriacigeorgica”由2個詞根組成：“cyriacum”新拉丁語中性名詞，來源于希臘語中性名詞“kuriakon”，意為教堂；“georgica”新拉丁語陰性名詞，意為“圣喬治”，“cyriacigeorgica”詞源意為圣喬治教堂[11]。諾卡菌鏡下形態(tài)呈分枝狀，弱抗酸性，屬內鑒定較復雜，需結合碳源利用試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化、脲酶、藥物敏感性等綜合進行[12]。16S rRNA基因和hsp65基因是目前較為常用的諾卡菌種基因鑒定靶位。諾卡菌的16S rRNA相似度較高，部分諾卡菌菌種16S rRNA基因存在多拷貝[13]，若需準確鑒定至種，相似度需大于99.8%。如本研究的A30菌株16S rRNA基因測序結果顯示在48位出現(xiàn)簡并堿基R(A/G)，多拷貝基因會影響比對結果準確性。圣喬治教堂諾卡菌為新命名菌種，在GenBank數(shù)據(jù)庫中的早期序列中，有將圣喬治教堂諾卡菌錯誤標記為星形諾卡菌，會影響鑒定結果。采用其他管家基因或構建系統(tǒng)進化樹，可增加鑒定的可信度。如hsp65基因，相似度大于99.5%，可提供準確的鑒定依據(jù)[8]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)為諾卡菌快速鑒定提供了新的方法。通過提取蛋白質法或菌液直接涂布法，均能準確鑒定圣喬治教堂諾卡菌。但大部分諾卡菌種培養(yǎng)物不易乳化或存在噬瓊脂現(xiàn)象，這會增加菌懸液制備難度而影響鑒定準確率，若選取早期培養(yǎng)菌落(菌齡小于48 h)，可提升質譜鑒定率[5]。

諾卡菌感染的首選用藥為復方磺胺甲噁唑，必要時可配伍亞胺培南。近年來不斷出現(xiàn)諾卡菌耐藥現(xiàn)象，特別是磺胺類藥物的耐藥。此外，CLSI推薦的微量肉湯稀釋法在多中心重復性研究中，重復性較低[14]，可能與該藥物MIC終點值判斷困難有關。通常終點值對應該孔80%菌量被抑制，但在實際操作中，由于諾卡菌浮于藥敏孔表面不易判斷抑菌量，或判讀人員經(jīng)驗不足，極易出現(xiàn)誤差。微量肉湯稀釋法配合紙片擴散法與E-test法，藥敏結果可相互驗證，可避免誤差[15]。本研究中A151菌株復方磺胺甲噁唑紙片擴散法抑菌圈直徑為19 mm，無法判斷敏感性，配合微量肉湯稀釋法與E-test法，可以確定其MIC值為1 μg/mL/38 μg/mL，依據(jù)CLSI M24-A2的折點范圍可判斷為敏感。依據(jù)CLSI標準，復方磺胺甲噁唑的藥敏試驗使用的磺胺甲噁唑/甲氧芐啶復方配比為19∶1，而臨床使用的復方磺胺甲噁唑磺胺甲噁唑/甲氧芐啶配比為5∶1。藥敏試驗復方配比與臨床復方制劑配比不同，可能導致體外藥敏結果無法有效預測感染治療效果?；前奉愃幬餅闈舛纫蕾囆?，需要足夠的濃度與對氨苯甲酸競爭結合二氫葉酸合成酶，臨床用藥參考藥敏標準時需要酌情考慮使用量。