程晨，孔子艷，孫闖，馬萍,，姜飛，顧兵,(.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 004；.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 00)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡稱單增李斯特菌)為革蘭陽性、不產(chǎn)芽孢桿菌，在自然界中廣泛存在，并能夠在低溫下生長的兼性胞內(nèi)寄生菌[1]。該菌可通過食源性途徑傳播，引起人類李斯特菌病(listeriosis)，導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、腦膜腦炎等，孕婦、新生兒、免疫功能低下者和老年患者易感[2]。盡管李斯特菌病發(fā)病率較低，但由于感染死亡率高(20%～30%)，曾有感染暴發(fā)報道[3-4]，從而引起全球廣泛關(guān)注。關(guān)于中國人群單增李斯特菌感染的病例報道較少，缺乏相關(guān)的分子多樣性數(shù)據(jù)[5]。本研究分析4例單增李斯特菌臨床感染病例，并對分離到的菌株進行毒力基因檢測、血清學(xué)分型以及同源性分析，以了解分離菌株的分子特征。

1 材料與方法

1.1患者信息與菌株來源 納入2018—2019年于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診為單增李斯特菌感染的患者4例，其中男性1例，女性3例，年齡1 d～79歲。4例患者診斷為敗血癥或神經(jīng)系統(tǒng)感染，其中3例存在基礎(chǔ)疾病，1例患兒母親產(chǎn)前過敏性紫癜和高熱。2例經(jīng)腦脊液標(biāo)本分離單增李斯特菌(LM1、LM4)，另2例經(jīng)血培養(yǎng)標(biāo)本分離(LM2、LM3)。所有分離株經(jīng)Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌分析儀和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀鑒定。沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812由徐州疾病預(yù)防控制中心提供，金黃色葡萄球菌ATCC 29213由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科微生物室提供。

1.2主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌分析儀(法國生物梅里埃公司)，MALDI-TOF MS儀(德國布魯克公司)，T100TMThermal Cycler PCR擴增儀、CHEF Mapper XA脈沖場凝膠電泳儀及配套設(shè)備、GelX1850凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，3730型DNA測序儀(美國ABI公司)；Oxoid抗菌藥物藥敏紙片(賽默飛世爾科技公司)，LB肉湯、哥倫比亞血瓊脂平板、M-H平板、MH-F平板(M-H瓊脂+5%脫纖維馬血+20 mg/L β-NAD)(青島海博公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)，1 000 bp DNA marker、Premix Taq、蛋白酶K、溶菌酶(日本TaKaRa公司)，限制性內(nèi)切酶AscⅠ、XbaⅠ(美國NEB公司)，引物合成(上海生工公司)。

1.3藥敏試驗 用紙片擴散法檢測單增李斯特菌藥物敏感性，包括11種測試抗菌藥物：氨芐西林、青霉素、美羅培南、紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素、氯霉素、利福平。其中，氨芐西林、青霉素、美羅培南、紅霉素和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑5種抗菌藥物的藥敏試驗選用MH-F培養(yǎng)基并參照2017年歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST)進行判讀[6]；其他6種抗菌藥物的藥敏試驗選用M-H培養(yǎng)基，參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)對葡萄球菌屬的抑菌圈直徑折點進行解釋[7]。

1.4DNA模板提取 將單增李斯特菌用LB肉湯復(fù)蘇并接種于哥倫比亞血平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，操作方法參照試劑說明書。提取后的DNA測定其濃度和純度，確保吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.6～1.9之間，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5毒力基因檢測和血清型分型 參照文獻[8]合成李斯特菌毒力島(prfA、actA、plcB、plcA、hly、hly2、mpl)及inlA、inlB基因引物，用PCR方法進行擴增。反應(yīng)體系為50 μL，包括Premix Taq 25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃(prfA、actA、plcB)/57 ℃(plcA、hly、hly2)/60 ℃(inlA、inlB)/62 ℃(mpl)45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用多重PCR擴增血清型相關(guān)基因lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs，進行血清分型[9]，反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 69 s，72 ℃ 69 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，取陽性產(chǎn)物經(jīng)3730型DNA測序儀進行Sanger雙脫氧鏈終止法雙向拼接測序，并與GenBank中的序列進行比對確證。測序工作均由上海生工公司完成。引物信息見表1。

表1 LM毒力基因和血清學(xué)分型所用引物

1.6多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)分型 參照MLST網(wǎng)站https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/，合成單增李斯特菌的7個管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA)，并參照文獻[10]反應(yīng)條件進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系同1.5。PCR產(chǎn)物純化后進行Sanger雙向測序，測序后拼接，將測序數(shù)據(jù)拼接提交上述網(wǎng)站比對，確定菌株ST型。使用eBURST V3.0程序(http://eburst.mlst.net/)，與單增李斯特菌的整個ST數(shù)據(jù)集進行比較(數(shù)據(jù)庫更新至2019年8月12日)。

1.7脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型 參照美國疾病預(yù)防控制中心Pulse-Net的PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行。調(diào)制4.0～4.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝粏卧隼钏固鼐鷳覞嵋?，用溶菌酶和蛋白酶K消化，使用限制性內(nèi)切酶AscⅠ 37 ℃酶切4 h。沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切。電泳參數(shù)為6 V/cm、4～40 s、19 h。電泳后的膠塊使用GelRed染色，純水脫色，經(jīng)GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)觀察。根據(jù)可視化分析對PFGE帶型進行結(jié)果判讀[11]，判讀標(biāo)準(zhǔn)為：條帶完全相同，視為同一克??；存在1～3條條帶差異，視為同一克隆不同亞型；存在3條以上條帶差異，視為不同克隆。

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果 4株單增李斯特菌均對氨芐西林、青霉素、美羅培南、紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氯霉素、利福平敏感，對克林霉素中介。

2.2毒力基因檢測與血清型分型 4株單增李斯特菌9種毒力基因(prfA、actA、plcB、plcA、hly、hly2、inlA、inlB、mpl)攜帶率為100%。LM1和LM4的lmo0737和prs基因擴增為陽性，lmo1118、ORF2819和ORF2110基因擴增為陰性，血清型為1/2a-3a；LM2和LM3的ORF2819和prs基因擴增為陽性，lmo0737、lmo1118和ORF2110基因擴增為陰性，血清型為1/2b-3b-7。

2.3MLST和PFGE分型 4株單增李斯特菌分為4種ST型：LM2為一新ST型，提交至MLST網(wǎng)站，獲得分型號ST1474(abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA：2-1-11-3-3-1-2)；另3株菌(LM1、LM3和LM4)ST型分別為ST121、ST619和ST621。用eBURST V3.0軟件對4株單增李斯特菌ST型與MLST數(shù)據(jù)庫中其他ST型進行進化分析，結(jié)果顯示，ST121屬于CC121克隆群，是該群的主要ST型；ST621屬于CC11克隆群，由管家基因abcZ-99取代了ST11的abcZ-7；ST1474屬于CC5克隆群，由管家基因lhkA-2取代了ST5的lhkA-2；ST619不與任何ST型形成克隆群。見圖1。4株單增李斯特菌經(jīng)限制性內(nèi)切酶AscⅠ酶切后表現(xiàn)為4種不同的PFGE帶型。見圖2。

注：方框中代表本研究4株菌株，其余粉色點代表同一時間段徐州地區(qū)分離的食源性菌株ST型在數(shù)據(jù)庫中的分布。

3 討論

本研究中4例患者為3例合并基礎(chǔ)疾病的老年人和1例早產(chǎn)兒，均屬于免疫力低下人群，早產(chǎn)兒母親產(chǎn)前存在高熱、過敏性紫癜癥狀，懷疑經(jīng)垂直傳播感染胎兒。4株單增李斯特菌分離株均對青霉素、氨芐西林等藥物敏感，但隨著近年來耐藥菌株的不斷出現(xiàn)[12]，應(yīng)加強單增李斯特菌的耐藥監(jiān)測，從而指導(dǎo)臨床合理用藥。4例患者初始治療方案為頭孢噻肟/舒巴坦(LM1、LM4)、亞胺培南(LM2)和美羅培南(LM3)。單增李斯特菌感染診斷明確后，改為哌拉西林/他唑巴坦(LM1)、萬古霉素(LM2、LM4)和青霉素(LM3)治療，3例患者痊愈出院，1例患者非醫(yī)囑出院(LM4)?？紤]治療單增李斯特菌感染的首選藥物在EUCAST均有判斷標(biāo)準(zhǔn)，此次實驗室提供的11種抗菌藥物的藥敏結(jié)果為紙片擴散法檢測結(jié)果，且臨床治療方案均依據(jù)細(xì)菌鑒定和藥敏結(jié)果作了調(diào)整并取得了良好的治療效果。

文獻報道inlA/B毒力基因在李斯特菌的黏附與侵襲方面發(fā)揮重要作用，李斯特菌毒力島(LIPI-1，也稱為prfA相關(guān)毒力基因簇，包括prfA、plcA、hly、plcB、mpl、actA)促進李斯特菌的胞內(nèi)感染、增殖和播散[13]。食源性菌株中inlA/B與LIPI在4b血清型單增李斯特菌中普遍存在，而在血清型1/2a、1/2b和1/2c中檢出相對較少，而人源性菌株中65%攜帶LIPI-1，60%同時攜帶LIPI-1 和inlA/B[8]。本研究單增李斯特菌臨床分離株均攜帶LIPI-1和inlA/B，與文獻報道相符，表明這些菌株可能具有強大的定植侵襲和致病能力。4株菌分為1/2a-3a和1/2b-3b-7 2種血清型，與中國北京、上海、臺灣等地[5,14-15]及歐洲一些國家臨床分離株主要血清型一致[16-17]。本研究受樣本量局限性影響，并沒有明確特定血清型與毒力基因間的聯(lián)系，需后續(xù)加大樣本量作進一步探究。

注：M，分子量標(biāo)準(zhǔn)(沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株 H9812)；1～4，單增李斯特菌LM1～LM4。

目前全球流行的單增李斯特菌克隆復(fù)合群包括CC1-CC9、CC87、CC121和CC155，我國ST87型臨床分離株是較常見的ST型[5]。但本研究中4株單增李斯特菌未檢出ST87，而檢出ST121、ST619、ST621和ST1474，且上述4種ST型在江蘇臨床分離株中為首次報道，其中ST1474為新ST型，提示細(xì)菌群體的變異進化，為單增李斯特菌流行病學(xué)監(jiān)測和微生物分子分型研究提供數(shù)據(jù)[18]。通過eBURST進化圖發(fā)現(xiàn)，本文中ST121、ST621、ST1474均與其他ST型構(gòu)成克隆復(fù)合群，但是通過與同時間段內(nèi)本地區(qū)食源性菌株相比，只有1株ST121菌株與人源性菌株相同，考慮到食源性菌株數(shù)量太少(9株)，且遺憾的是本研究在分離得到單增李斯特菌之后，并未及時對患者接觸的食品以及早產(chǎn)兒的母親進行溯源追蹤，因此未能明確其傳染源及傳播途徑。同時，PFGE結(jié)果的多樣性也表明此次單增李斯特菌感染病例為散發(fā)病例。因此，作為食源性傳染病原體，建立區(qū)域性單核細(xì)胞增生李斯特菌監(jiān)測系統(tǒng)，追蹤人感染單增李斯特菌的食物來源及傳播途徑，可為防治單增李斯特菌感染及其分子進化提供重要信息。這將是我們下一步研究的重點。

致謝：感謝徐州市疾病預(yù)防控制中心余峰玲老師提供的徐州地區(qū)食源性單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株信息。