馬進，孫芬芳，周霞，阮緒文，張淼

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院食品系，山東萊陽265200）

梨是我國主要水果之一，素有“梨鄉(xiāng)”美譽的萊陽，其主要種植品種——茌梨是山東梨類傳統(tǒng)名貴品種之一[1]。梨果除了以鮮果消費外，其加工產(chǎn)品眾多，如濃縮梨汁、梨膏等。隨著梨加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其加工副產(chǎn)物梨渣的產(chǎn)出也逐年增加。梨渣富含黃酮[2]、多糖[3]、多酚[4]、果膠[5]、酯類物質(zhì)[6]、酸類物質(zhì)[7]和膳食纖維[8-9]等多種功能性營養(yǎng)成分，對這些功能性物質(zhì)進行提取利用，是增加梨果附加值、提高梨產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值的有效途徑。國內(nèi)外學(xué)者在這方面做了很多有益的嘗試。陳樹俊等[3]采用超聲輔助法提取了黃梨渣中的多糖并對其進行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定；趙國群等[10]對超聲波輔助提取梨渣中酯類物質(zhì)的工藝研究進行了的報道。鄒蘭等[11]報道了蘋果梨渣膳食纖維的堿法制備工藝并對其物化特性進行研究；You等[12]探索了梨渣水提物對大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的保護作用，結(jié)果表明梨渣水提物是一種有價值的天然抗氧化劑，可用于保健食品工業(yè)。

黃酮類物質(zhì)因具有抗氧化[13-15]、抗腫瘤[16-17]、抑菌[18-19]、降糖[20]、抗衰老[21-24]等多種生物活性而受到廣泛關(guān)注，然而從梨渣中提取黃酮的研究鮮見報道。本文擬采用響應(yīng)面法對超聲輔助提取梨渣中黃酮類物質(zhì)的工藝進行優(yōu)化，并探索其抗氧化性，以期為萊陽梨資源的綜合利用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萊陽茌梨渣：由萊陽當(dāng)?shù)氐睦嬷a(chǎn)廠提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海展云化工有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平（BSA224S-CW型）：德國賽多利斯集團；超純水機（FBZ2002-UP-P型）：青島富勒姆科技有限公司；超聲波清洗機（SB-4200DTN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式離心機（800B）：上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本試驗采用亞硝酸鈉—硝酸鋁分光光度法對提取液的黃酮含量進行測定，通過與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值進行對比，得到提取液內(nèi)的黃酮類物質(zhì)含量，計算得率[24]。準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.126 g，30%的乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻備用。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于50mL容量瓶中，各加入30%的乙醇使其體積為25mL；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1.5 mL搖勻，放置6 min；加入10%的Al（NO3）3溶液1.5 mL搖勻，放置6 min；加1 mol/L的NaOH溶液20 mL，30%乙醇定容至刻度并搖勻，放置15 min。以空白為對照，于510 nm波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.010 19x-0.223 95，R2=0.999 8。

1.3.2 萊陽茌梨渣總黃酮的提取

將梨渣自然晾干，用粉碎機粉碎，過60目篩，儲存于棕色廣口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取梨渣粉1 g（精確至0.01 g），按照不同料液比要求加入乙醇溶液，搖勻，放在超聲波清洗器中進行超聲波輔助提取，提取完成后離心分離，收集上清液，定容后測定提取液中的總黃酮濃度，按公式計算梨渣中總黃酮提取量。

1.3.3 單因素對黃酮提取量的影響

考察單因素乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），超聲溫度（30、40、50、60、70℃），液料比[（10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）]，超聲時間（20、30、40、50、60 min）對梨渣黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方法進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。本試驗以總黃酮提取量為響應(yīng)值，選取A超聲溫度、B超聲時間、C乙醇體積分?jǐn)?shù)、D液料比四因素三水平進行試驗設(shè)計。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3.5 抗氧化性研究

1.3.5.1 還原能力的測定

參考鄧夢琴等[23]的方法稍作修改。取不同質(zhì)量濃度的樣品1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的鐵氰化鉀溶液2 mL，混勻，在50℃水浴20 min后，加入10%三氯乙酸溶液2 mL，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL加入2 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min后，在700 nm波長處測定其吸光度，平行測定吸光度3次，以蒸餾水調(diào)零。吸光度越大表示其還原力越強。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率

參照徐柯等[2]使用的方法，并在此基礎(chǔ)上進行少量改動。向2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中加入不同質(zhì)量濃度的黃酮提取液2.0 mL，避光反應(yīng)25 min后，于517nm波長處測吸光度記為Ai，同時測定2.0mL無水乙醇溶液與2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度記為Ac，及2.0 mL無水乙醇與不同質(zhì)量濃度的黃酮提取液2.0 mL混合液的吸光度記為Ab。清除率計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel2016對單因素試驗數(shù)據(jù)作圖并利用Design－Expert8.0.6進行響應(yīng)面試驗設(shè)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對萊陽茌梨渣中總黃酮提取的影響

超聲溫度對萊陽茌梨渣中總黃酮提取的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effectofultrasonictemperatureontotalflavonoidextraction

由圖1可知，當(dāng)超聲溫度為30℃～50℃時，總黃酮提取量隨著超聲溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達到50℃時，總黃酮提取量達到最大，為5.03 mg/g。當(dāng)超聲溫度高于50℃，總黃酮提取量反而降低，這可能由于溫度升高導(dǎo)致分子運動增加，使黃酮與溶劑接觸增加，更易溶于溶劑中，故總黃酮提取量增加，但溫度太高的話，會導(dǎo)致部分黃酮氧化，使測定的黃酮濃度降低。因此將超聲溫度設(shè)定為50℃。

2.1.2 超聲時間對萊陽茌梨渣中總黃酮提取的影響

超聲時間對總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 超聲時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on total flavonoid extraction

由圖2可知，超聲時間在20 min～40 min時，總黃酮提取量隨著超聲時間延長而明顯增加，超聲時間為40 min時，總黃酮提取量達到最大5.25 mg/g；提取時間超過40 min時，總黃酮提取量隨著時間的增加反而呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于乙醇具有揮發(fā)性，時間越久乙醇濃度越小，提取溶劑極性變大，導(dǎo)致小部分極性小的黃酮類化合物從溶液中析出，降低提取液中黃酮的濃度。因此將超聲時間設(shè)定為40 min。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對萊陽茌梨渣中總黃酮提取的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度小于60%時，所提取總黃酮提取量隨著乙醇濃度增大而增加，當(dāng)乙醇濃度達到60%時，總黃酮提取量到達頂峰，為5.12 mg/g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，總黃酮提取量迅速下降，這可能因為當(dāng)乙醇濃度達到一定程度之后可能會影響黃酮類溶解性及其醇溶性雜質(zhì)、色素增多，這些雜質(zhì)會與黃酮競爭溶劑，導(dǎo)致黃酮類化合物的溶解度降低。因此將乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定60%。

2.1.4 液料比對萊陽茌梨渣中總黃酮提取的影響

液料比對總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 液料比對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on total flavonoids extraction

由圖4可知，總黃酮提取量隨著液料比的增加而增大，當(dāng)液料比 40∶1（mL/g）時達到最大為 5.22 mg/g，之后隨著液料比的增加總黃酮提取量呈現(xiàn)下降趨勢，其原因可能是隨著液料比的增大，黃酮中的其他成分也會溶出或者部分黃酮類化合物與溶劑長時間接觸會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，使得總黃酮提取量降低，因此將液料比設(shè)定為 40 ∶1（mL/g）。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析

Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

對表2梨渣總黃酮提取量的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合后，由統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6分析，建立二次多元回歸方程：總黃酮提取量=5.17+0.10A+0.29B-0.21C+0.41D+0.14AB+0.072AC-0.26AD+0.39BC-0.095BD-0.57A2-0.36B2-0.41C2-0.24D2。

表3 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experimental results

從表3可以看出，建立的模型F值為7.83（p＜0.001），說明該模型差異極顯著，只有0.02%的可能是由于噪聲而產(chǎn)生如此大的F值。失擬項p值為0.046 201小于0.05，說明差異顯著。此外，D、A2對總黃酮提取量影響差異極顯著，B、B2、C2對總黃酮提取量差異高度顯著，C、BC、D2對總黃酮提取量差異顯著，A、AB、AC、AD、BD、CD 項不顯著（p＞0.05），需將此 6項從回歸模型中刪除?；貧w模型方程最終為：總黃酮提取量=5.17+0.29B-0.21C+0.41D+0.39BC-0.57A2-0.36B2-0.41C2-0.24D2。

2.2.2 交互作用

各因素交互作用對梨渣總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對梨渣總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of various factors on total flavonoid extraction from pear residue

利用Design expert 8.0.6軟件繪制出4個因素中任意兩因素之間的交互作用響應(yīng)面分析圖。交互作用對于總黃酮提取量影響越顯著意味著響應(yīng)曲面的陡峭程度越大。由圖5a可知，隨著超聲溫度和超聲時間的增加，總黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，兩者交互作用曲面較陡，對總黃酮提取量影響顯著。由圖5b可知，隨著超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，兩者交互作用曲面較陡，對總黃酮提取量影響顯著。由圖5c可知，總黃酮提取量分別隨著超聲溫度和液料比的增加呈現(xiàn)上升的趨勢然后趨于平緩。由圖5d可知，超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響呈拋物線的趨勢，即隨著超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取量呈先升高后下降的趨勢。

2.2.3 驗證試驗結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化后得到的最佳提取條件為超聲溫度48℃、超聲時間43min、乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、液料比47∶1（mL/g）此時總黃酮理論提取量為5.38 mg/g。為驗證最佳提取條件的準(zhǔn)確性，設(shè)定超聲溫度48℃、超聲時間43 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、液料比47∶1（mL/g）進行試驗，得到的總黃酮提取量為5.25 mg/g，與理論值接近，說明該工藝穩(wěn)定可靠，具有一定價值。

2.3 抗氧化性研究

2.3.1 還原能力的測定

不同濃度黃酮溶液還原能力的測定見圖6。

圖6 不同濃度黃酮溶液還原能力的測定Fig.6 Determination of reduction capacity of sample solution with different concentrations

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增加其吸光度也在不斷增加，還原能力增強，當(dāng)濃度增加至26 μg/mL，吸光度達到0.2，此后其吸光度基本趨于平衡。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定

不同濃度黃酮溶液對DPPH自由基清除率的測定見圖7。

圖7 不同濃度黃酮溶液對DPPH自由基清除率的測定Fig.7 Determination of DPPH removal rate of different concentration sample solution

由圖 7 可知，當(dāng)濃度在 5 μg/mL～40 μg/mL 范圍內(nèi)DPPH自由基清除能力隨黃酮濃度的提高而增強，當(dāng)濃度增加到35 μg/mL，清除率達到80%，此后其清除率基本趨于平衡。此試驗表明黃酮對DPPH自由基有較高的清除率，抗氧化能力較強。

3 結(jié)論

梨渣中含有大量的黃酮類化合物，應(yīng)用超聲波輔助提取技術(shù)可實現(xiàn)其中的總黃酮的快速提取，本文通過超聲輔助提取法提取梨渣中的黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對梨渣中黃酮提取工藝進行優(yōu)化，超聲溫度48℃、超聲時間43 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、液料比47∶1（mL/g）時總黃酮提取量為5.25 mg/g。體外抗氧化活性研究表明，梨渣中黃酮對Fe3+還原能力較強，并對DPPH自由基有較高的清除率，是一種潛在的天然抗氧化活性物質(zhì)，預(yù)期可以在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑方面有所應(yīng)用。