池強(qiáng)偉,趙 暢,李紹堂

池強(qiáng)偉,趙暢,李紹堂,溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸外科 浙江省溫州市 325000

0 引言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及病死率仍居高不下,每年有接近140萬人的新發(fā)確診病例和70萬人的死亡病例[1].盡管近年來多種抗癌策略的發(fā)展改善了CRC的治療效果,但仍有很高比例的患者最終出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后非常差[2,3].目前,有一些血清標(biāo)記物已廣泛用于CRC的預(yù)后監(jiān)測,如癌胚抗原、糖類抗原等,但其對(duì)CRC的預(yù)后價(jià)值仍不理想[4-6].因此,鑒定一個(gè)敏感的分子標(biāo)志物來早期發(fā)現(xiàn)預(yù)后較差的CRC患者對(duì)CRC的治療和預(yù)后監(jiān)測具有重要意義.

Homeobox B8 (HOXB8)基因?qū)儆贖omeobox基因家族的成員之一,位于17號(hào)染色體,其編碼的蛋白質(zhì)是一種參與胚胎發(fā)育的序列特異性轉(zhuǎn)錄因子[7].據(jù)報(bào)道,HOXB8在CRC細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)[8],并且這種情況在CRC發(fā)展的各個(gè)階段都有出現(xiàn)[9].然而,目前還沒有證據(jù)表明HOXB8可以作為一個(gè)敏感的生物標(biāo)記物來預(yù)測CRC患者的預(yù)后.

本研究基于腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫,收集和分析了CRC患者的HOXB8的mRNA表達(dá)信息和相關(guān)臨床預(yù)后資料,探索HOXB8與CRC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,建立了具有良好預(yù)后判斷價(jià)值的列線圖,為CRC的研究開拓新的思路.

1 材料和方法

1.1 材料 數(shù)據(jù)來源和處理:從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://portal.gdc.cancer.gov)下載臨床和生存資料完善的RNA測序數(shù)據(jù),包括538個(gè)CRC患者樣本和44個(gè)正常組織樣本[10].使用R軟件(R version 3.6.0)讀入下載的mRNA數(shù)據(jù),并將每個(gè)mRNA的readcounts值轉(zhuǎn)化成TPM值以便后續(xù)進(jìn)行表達(dá)水平比較,接著對(duì)探針進(jìn)行基因名稱注釋,最終提取HOXB8的mRNA的表達(dá)量和相應(yīng)臨床數(shù)據(jù).對(duì)HOXB8在CRC患者中的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并初步評(píng)估HOXB8與CRC患者的預(yù)后關(guān)系.此外,以HOXB8的中位表達(dá)量為分組依據(jù)將538個(gè)CRC樣本分為HOXB8高表達(dá)組和低表達(dá)組,收集并統(tǒng)計(jì)其臨床基線資料.

1.2 方法 單因素和多因素COX回歸分析:首先,我們使用Cox回歸模型對(duì)CRC患者的相關(guān)臨床病理因素進(jìn)行單因素生存分析,包括診斷時(shí)的年齡(＞65歲,≤65歲)、性別、腫瘤位置、HOXB8表達(dá)水平、是否接受放療、TNM分期(AJCC標(biāo)準(zhǔn)),生存時(shí)間包括總生存期(overall survival,OS)和無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS).接著,將單因素COX分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素COX分析篩選預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素.

1.3 列線圖的構(gòu)建與評(píng)價(jià) 基于上述建立的多因素COX分析模型,我們使用R軟件的survival包和rms (Regression Modeling Strategies)包將預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素可視化建立列線圖.接著我們使用一致性指數(shù)(concordance index,C指數(shù))、標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]和臨床決策曲線(decision curve analyses,DCA)[12]來評(píng)價(jià)列線圖的區(qū)分度、準(zhǔn)確性和臨床實(shí)用性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有的統(tǒng)計(jì)分析均在R 3.6.0軟件中完成,包括HOXB8表達(dá)比較、生存分析、單因素和多因素的COX分析、列線圖構(gòu)建、一致性指數(shù)的計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線和DCA的繪制.HOXB8的mRNA表達(dá)量使用log2(TPM+1)表示,兩組組間比較采用Wilcoxon檢驗(yàn).臨床基線特征的組間差異采用卡方檢驗(yàn).HOXB8的生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析.P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 CRC患者的臨床特征資料和HOXB8的表達(dá)情況我們一共統(tǒng)計(jì)了538例患者資料,其臨床特征資料收入表1.統(tǒng)計(jì)分析顯示HOXB8高表達(dá)與CRC的腫瘤位置(P＜0.001)、T分期(P=0.050)相關(guān)(表1).HOXB8的表達(dá)分析顯示HOXB8在CRC腫瘤組織(P＜0.001)、右半CRC(P＜0.001)、晚期T分期(P=0.024)、M1分期(P=0.0074)中均存在不同程度的表達(dá)上調(diào)(圖1).如圖2所示,生存分析顯示HOXB8的高表達(dá)與CRC患者更差的PFS的相關(guān)(P=0.0019).

2.2 單因素和多因素COX分析 在單因素分析中,年齡[HR:2.214 (1.449-3.381),P＜0.001]、T分期(P＜0.001)、N分期(P＜0.001)、M分期(P＜0.001)、總分期(P＜0.001)與CRC患者的OS相關(guān);而HOBX8的高表達(dá)[HR:1.742(1.222-2.482),P=0.002]、T分期(P＜0.001)、N分期(P＜0.001)、M分期(P＜0.001)、總分期(P＜0.001)則與PFS相關(guān)(表2).接著我們將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量如年齡、T、N、M分期納入OS的多因素COX分析,同時(shí)把HOBX8表達(dá)水平、T、N、M階段納入PFS的多因素COX分析(為避免多重共線性,均沒有將總分期與TNM共同納入多因素分析).在多因素分析中,年齡[HR:2.508 (1.628-3.864),P＜0.001]、T階段(P=0.016)、N階段(P＜0.001)、M階段(P＜0.001)與CRC患者的OS相關(guān);而HOBX8的高表達(dá)[HR:1.539 (1.066-2.221),P=0.021]、T階段(P=0.016)、N階段(P=0.004)、M階段(P＜0.001)則與CRC患者的PFS相關(guān)(表3).

2.3 列線圖的構(gòu)建 經(jīng)過單因素和多因素COX分析,我們發(fā)現(xiàn)HOXB8的表達(dá)水平及TNM分期與CRC的PFS相關(guān).為了更好的預(yù)測CRC患者的預(yù)后情況,我們通過rms包和survival包將上述多因素COX模型可視化建立了列線圖(圖3).

2.4 列線圖的評(píng)價(jià) 為了評(píng)估所建立的列線圖的價(jià)值,我們計(jì)算和構(gòu)建了C指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和DCA.該列線圖C指數(shù)的計(jì)算結(jié)果為0.735,大于0.7提示該列線圖的區(qū)分度較好.標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果顯示列線圖在估計(jì)3年和5年P(guān)FS預(yù)測值與實(shí)際觀測值之間展現(xiàn)了較好的可接受的一致性(圖4),提示該列線圖的準(zhǔn)確度較好.另外,DCA分析顯示列線圖預(yù)測3年和5年P(guān)FS在較廣的閾值概率范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的凈效益,說明該列線圖的臨床實(shí)用性和可靠性較好(圖5).

3 討論

HOX基因是一段長度約183 bp的核苷酸序列,編碼高度保守的61個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域.目前,已鑒定出39種人類HOX基因,將其分為HOXA,HOXB,HOXC,HOXD四個(gè)簇,分別位于7p15、17p21、12q13和2q31染色體上[13,14].HOXB8是Hox基因家族的一員.近年來越來越多的證據(jù)表明HOXB8在人類癌癥中表達(dá)失調(diào),與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),包括胃癌,結(jié)腸直腸癌和卵巢漿液性癌等[15-17].在CRC中HOXB8能通過激活STAT3誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT),進(jìn)而參與CRC細(xì)胞的發(fā)生,發(fā)展和進(jìn)展[17].同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn)HOXB8的過表達(dá)與CRC細(xì)胞化療耐藥也存在密切相關(guān)[18].Shen等[19]的實(shí)驗(yàn)證明miR-196通過上調(diào)HOXB8的表達(dá)使CRC患者對(duì)術(shù)前新輔助化療FOLFOX4方案的治療反應(yīng)變差,從而影響患者預(yù)后.Lu等[20]的研究中利用HOXB8等7個(gè)基因建立了預(yù)測肝轉(zhuǎn)移的CRC患者對(duì)FOLFOX4化療方案治療敏感性的預(yù)測模型,并且表現(xiàn)出很好的預(yù)測能力.以上發(fā)現(xiàn)提示HOXB8有希望成為一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物,用于CRC治療反應(yīng)檢測和預(yù)后評(píng)估.

表1 來源于腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫的538例結(jié)直腸癌患者的臨床特征資料

TCGA是一個(gè)具有里程碑意義的癌癥基因組學(xué)計(jì)劃,收集了33種不同癌癥類型、11000多個(gè)人類腫瘤樣本的臨床病理數(shù)據(jù)以及多平臺(tái)分子圖譜,其對(duì)于癌癥的研究有著不可估量的價(jià)值[10].本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫,獲得HOXB8的mRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)和相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,探索HOXB8在CRC種表達(dá)和預(yù)后判斷價(jià)值.

圖1 HOXB8在結(jié)直腸癌中的表達(dá).A:腫瘤與正常組織;B:左右半結(jié)直腸癌;C:T1-4分期;D:M1分期.

圖2 HOXB8的生存分析.

本研究首先比較了HOXB8在CRC中的mRNA表達(dá)水平,評(píng)估其表達(dá)與CRC相關(guān)臨床特征間的關(guān)系.我們發(fā)現(xiàn)HOXB8在CRC腫瘤組織中顯著高表達(dá),同時(shí)還與T分期和M分期之間存在密切相關(guān).林飛燕等[21]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)的HoxB8基因能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,同時(shí)HoxB8能夠增強(qiáng)CRC細(xì)胞的遷移能力.這與本研究結(jié)果相一致,都提示了HOXB8在腫瘤發(fā)生發(fā)展、局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起重要作用.其次,我們還發(fā)現(xiàn)HOXB8在不同腫瘤位置的CRC中也有差異表達(dá).以往的研究已經(jīng)證明左半和右半CRC之間在病理類型、臨床表現(xiàn)、預(yù)后與化療耐藥等方面均存在顯著不同[22-24].然而,其潛在的分子機(jī)制還不甚清楚.對(duì)HOXB8深入探索或許能為研究左右半結(jié)腸癌提供新的思路.另外,HOXB8的生存分析也表明其表達(dá)與CRC患者的PFS密切相關(guān).因此,我們推斷HOXB8可能在CRC的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用,導(dǎo)致結(jié)果截然不同的化療耐藥和預(yù)后.

表2 結(jié)直腸癌患者的總生存期與無進(jìn)展生存期的單因素COX分析

圖3 結(jié)直腸癌患者的3年和5年無進(jìn)展生存期預(yù)測列線圖.

其次,為了評(píng)估HOXB8在CRC中的預(yù)后價(jià)值,我們進(jìn)行了單因素和多因素COX分析,發(fā)現(xiàn)HOXB8的表達(dá)水平、TNM分期是CRC患者獨(dú)立預(yù)后因素.為了更好的預(yù)測CRC患者的PFS,我們依據(jù)上述的預(yù)后因素將COX模型可視化后建立了列線圖,并全面地對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXB8在預(yù)測CRC患者3年和5的PFS中表現(xiàn)良好.這些結(jié)果進(jìn)一步證明了HOXB8在CRC中預(yù)后價(jià)值.

表3 結(jié)直腸癌患者的總生存期與無進(jìn)展生存期的多因素COX分析

圖4 列線圖預(yù)測3年和5年無進(jìn)展生存期的標(biāo)準(zhǔn)曲線.A:3年無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的預(yù)測;B:5年P(guān)FS的預(yù)測.PFS:無進(jìn)展生存期.

圖5 列線圖預(yù)測3年和5年無進(jìn)展生存期的臨床決策曲線.A:3年無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的臨床決策曲線(decision curve analyses,DCA);B:5年P(guān)FS的DCA.

4 結(jié)論

綜上所述,HOXB8的表達(dá)與CRC患者預(yù)后密切相關(guān),對(duì)CRC患者的疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測能力.HOXB8可以作為一種潛在的生物標(biāo)記物來識(shí)別高危CRC患者,有希望成為CRC的新治療靶點(diǎn)和預(yù)后監(jiān)測指標(biāo).同時(shí),還需要進(jìn)行更深入的分子基礎(chǔ)研究和隨機(jī)化臨床試驗(yàn),來揭示HOXB8與CRC患者的預(yù)后之間的作用機(jī)制及HOXB8在CRC中的臨床應(yīng)用.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤,目前CRC患者仍有很高比例的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響預(yù)后.同時(shí),HOXB8與CRC發(fā)生發(fā)展相關(guān).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

基于CRC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)居高不下,本研究旨在探討HOXB8基因在CRC患者預(yù)后中的判斷價(jià)值,為監(jiān)測高危CRC的疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供思路.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究希望了解HOXB8基因的表達(dá)與CRC患者相關(guān)病理特征及預(yù)后的聯(lián)系,并利用HOXB8建立一個(gè)全新的及有價(jià)值的CRC預(yù)后模型.

實(shí)驗(yàn)方法

通過分析腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中的HOXB8表達(dá)數(shù)據(jù)與CRC臨床病理因素及生存預(yù)后之間的關(guān)系,然后基于HOXB8建立一個(gè)新的CRC預(yù)后模型及列線圖,并對(duì)其進(jìn)行全面科學(xué)的驗(yàn)證和評(píng)價(jià).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HOXB8主要在CRC腫瘤組織、右半CRC及較晚的臨床分期中呈現(xiàn)高表達(dá).生存分析顯示HOXB8的高表達(dá)與CRC患者更差的無進(jìn)展生存期的相關(guān).基于HOXB8建立的CRC預(yù)后模型及列線圖具有良好的預(yù)測價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

HOXB8的表達(dá)與CRC患者預(yù)后密切相關(guān),對(duì)CRC患者的疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測能力.

展望前景

HOXB8可以作為一種潛在的生物標(biāo)記物來識(shí)別高危CRC患者,有希望成為CRC的新治療靶點(diǎn)和預(yù)后監(jiān)測指標(biāo).