顧宗廷,李宗澤,王成鋒

顧宗廷,李宗澤,王成鋒,國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/胰胃外科 北京市 100021

0 引言

胰腺癌是人類最具致命的惡性腫瘤之一,胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是其中最常見的類型,約占90%.盡管PDAC治療技術(shù)不斷進(jìn)步,但在過去40年中生存率改善有限,其5年生存率仍低于9%,且在所有實(shí)體瘤中預(yù)后最差[1].目前,手術(shù)切除仍是PDAC患者唯一可能治愈的手段,但由于缺乏明確的臨床癥狀或體征使得早期診斷變得異常困難.因此,僅有15%-20%的患者有手術(shù)切除的指征[2],對于臨界可切除、進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性PDAC而言,全身化療(包括新輔助)則是最主要甚或唯一的治療方案.其中,核苷類似物吉西他濱(gemcitabine,GEM)的單藥或聯(lián)合治療仍是目前PDAC化療的一線方案[3].GEM作為一種前藥進(jìn)入PDAC細(xì)胞,經(jīng)過一系列精密調(diào)控的磷酸化過程,其衍生物可以干擾DNA合成并阻止癌細(xì)胞周期的進(jìn)展[4](圖1).但GEM治療胰腺癌的總反應(yīng)率不足20%,約80%的患者可在1年內(nèi)因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[5].PDAC對GEM的耐藥是影響化療療效并導(dǎo)致預(yù)后不良的最重要原因之一.因此,克服GEM耐藥仍是PDAC治療中面臨的主要挑戰(zhàn)之一[6].腫瘤異質(zhì)性是PDAC耐藥性產(chǎn)生的主要原因,其與腫瘤微環(huán)境、遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定、細(xì)胞內(nèi)信號分子調(diào)控等密切相關(guān),因此GEM耐藥機(jī)制十分復(fù)雜,可能涉及先天性和獲得性兩個(gè)方面,但細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)控是實(shí)現(xiàn)GEM抵抗的最終途徑(圖2).本文將重點(diǎn)討論GEM在PDAC細(xì)胞內(nèi)的代謝和信號通路調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展(表1).針對這些細(xì)胞及分子機(jī)制的進(jìn)一步研究將有助于開發(fā)新的化療增敏策略,提高GEM化療有效率,改善總體預(yù)后.

1 GEM細(xì)胞內(nèi)代謝與調(diào)控

1.1 GEM的攝取與外排 GEM是一種脫氧胞苷核苷類似物(2′,2′-difluorodeoxycytidine,dFdC),其靶點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi).由于與核苷的結(jié)構(gòu)相似,dFdC的攝取由核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(nucleoside transporter,NTs)負(fù)責(zé),NTs分為濃縮核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(human concentrative nucleoside transporters,hCNTs)和平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(human equilibrative nucleoside transporters,hENTs)兩大類[7].dFdC的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)主要由hENT1介導(dǎo),也有少量由hENT2、hCNT1和hCNT3介導(dǎo)[8](圖1).之前的研究表明,hENT1的高表達(dá)與胰腺癌患者更長的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival,DFS)有關(guān),hENT1的表達(dá)水平可作為GEM化療的胰腺癌切除患者的預(yù)后評價(jià)指標(biāo)[9].通過增加hENT1的表達(dá)來促進(jìn)dFdC的細(xì)胞內(nèi)攝取是一種已知的化療增敏機(jī)制[7].此外,hENT1活性也是癌細(xì)胞對GEM敏感性的重要決定因素,因此hENT1的缺乏或活性降低可能是導(dǎo)致GEM耐藥的原因之一[10].另外,藥物抑制hCNT1降解也增加了dFdC的轉(zhuǎn)運(yùn),改善GEM的藥效[11].hCNT3高表達(dá)也與OS延長有關(guān)[12].遺憾的是,最近有一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)(JASPAC 01)顯示,GEM組中ENT1的高表達(dá)與OS無關(guān)[13].有趣的是,GEM的飽和吸收是由其高親和力和低親和力成分介導(dǎo)的,高親和力和低親和力位點(diǎn)分別對應(yīng)與hENT1和hENT2結(jié)合[14].最近一項(xiàng)有關(guān)PDAC伴肝轉(zhuǎn)移行動(dòng)脈灌注GEM化療的研究顯示,GEM的肝臟攝取主要由在不飽和條件下的hENT2決定,提示hENT2的表達(dá)水平可作為PDAC伴肝轉(zhuǎn)移患者選擇動(dòng)脈灌注GEM化療的標(biāo)志物[15].此外,MUC4作為一種高分子量的跨膜黏蛋白(Mucin,MUC)在PDAC中高表達(dá)[16],MUC4蛋白可通過NF-κB途徑負(fù)調(diào)控hCNT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),MUC4的沉默通過增加hCNT1的表達(dá)提高對GEM的敏感性[17].GEM化療耐藥的另一機(jī)制是調(diào)節(jié)藥物外排.多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein,MRP)是一類ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)泵,其逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能量來自ATP的水解,它介導(dǎo)GEM等一系列化療藥的外流,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度并促進(jìn)耐藥發(fā)生[18](圖1).在PDAC中,MRP1、MRP5是GEM外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體,且在PDAC細(xì)胞系中GEM誘導(dǎo)其表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性[19].MRP1抑制劑研究已成為化療增敏的重要策略[20,21].最新一項(xiàng)研究表明,阿霉素可作為熒光報(bào)告分子,用于識別新型的MRP1抑制劑[21].總之,對GEM流入/流出的蛋白調(diào)控的進(jìn)一步研究有助于發(fā)現(xiàn)新的抗GEM耐藥靶點(diǎn).

表1 胰腺癌的細(xì)胞內(nèi)核苷類似物吉西他濱耐藥潛在靶點(diǎn)和功能

圖1 胰腺癌的細(xì)胞內(nèi)吉西他濱作用機(jī)制.dCK:脫氧胞苷激酶;NMPK:核苷一磷酸激酶;NDPK:核苷二磷酸激酶;RR:核糖核酸還原酶;CDA:胞苷脫氨酶.

圖2 胰腺癌的細(xì)胞內(nèi)吉西他濱耐藥相關(guān)通路.EMT:上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;GEM:吉西他濱;ncRNA:非編碼RNA.

1.2 GEM的代謝 圖1顯示了dFdC的細(xì)胞內(nèi)代謝過程.dFdC進(jìn)入細(xì)胞膜后,被磷酸化限速酶脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,dCK)連續(xù)磷酸化成dFdC一/二/三磷酸核苷(dFdCMP/ dFdCDP/ dFdCTP).其中,dFdCTP 是DNA合成原料三磷酸脫氧胞苷(deoxycytidine triphosphate,dCTP)的競爭性底物,DNA聚合酶在復(fù)制中將競爭性dFdCTP摻入DNA中,終止DNA鏈的延長,并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22].有趣的是,DNA聚合酶允許在將dFdCTP與DNA鏈結(jié)合后再配對一個(gè)核苷酸,導(dǎo)致核酸外切酶不能識別和修復(fù)DNA,這一過程又被稱之為“終止鏈屏蔽”[8].同時(shí),dFdCDP和dFdCTP這兩種活性代謝物能有效抑制核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase,RR),RR是DNA合成途徑中的限速酶(RRM1、RRM2),主要負(fù)責(zé)將核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為對DNA組裝和修復(fù)至關(guān)重要的三磷酸脫氧核糖核苷(deoxyribonucleoside triphosphates,dNTPs),其抑制作用導(dǎo)致DNA合成所需的原料dCTP池濃度降低,從而進(jìn)一步促進(jìn)dFdCTP競爭性結(jié)合DNA.另外,dFdCDP和dFdCTP還可抑制dCMP脫氨酶(cytidine deaminase,CDA),后者可將dFdCMP分解為無活性的單磷酸二氟脫氧尿苷(dFdUMP)[23].通過上述獨(dú)特的正反饋的機(jī)制,既減少了競爭性的dCTP池,又減少了分解代謝,極大維持了細(xì)胞內(nèi)GEM的活性和有效濃度.

作為dFdC細(xì)胞內(nèi)代謝的關(guān)鍵限速酶,dCK和RR在化療耐藥中的作用已逐漸被揭示.體外和體內(nèi)試驗(yàn)均證實(shí)dCK活性與GEM敏感性呈正相關(guān)[24].敲除dCK基因可導(dǎo)致GEM耐藥,而過度表達(dá)dCK基因則可恢復(fù)PDAC細(xì)胞對GEM的化療敏感性[25].臨床免疫組化亦證實(shí),胰腺癌組織中dCK的表達(dá)水平是術(shù)后GEM化療患者的預(yù)后影響指標(biāo)之一[26].一項(xiàng)最新的研究將脫氧胞苷(deoxycytidine,dC)作為化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(chemical exchange saturation transfer,CEST)MRI的成像探針用于檢測dCK活性,這為臨床評估GEM抗性和預(yù)測療效提供了可能[27].與之類似,RR抑制也是GEM敏感性增強(qiáng)的重要機(jī)制.PDAC細(xì)胞系中 RRM1、RRM2蛋白過度表達(dá)可獲得穩(wěn)定的GEM抗性[28].最近的一項(xiàng)Meta分析顯示,相對于RRM1高表達(dá)的GEM化療患者,低表達(dá)的患者有更長的OS和DFS[29].因此,RR也是預(yù)測胰腺癌GEM耐藥的潛在標(biāo)志物[30].此外,CDA在GEM化療耐藥中的作用也逐漸引起重視[31,32].最近一項(xiàng)研究顯示,在誘導(dǎo)GEM耐藥的PDAC細(xì)胞系中,CDA的表達(dá)顯著增加,CDA過表達(dá)與GEM的耐藥性有關(guān)[33],而CDA下調(diào)則與GEM早期毒性反應(yīng)相關(guān)[34].因此,CDA過表達(dá)可能是GEM化療耐藥性的標(biāo)志,且CDA有望成為增強(qiáng)GEM化療敏感性的新靶標(biāo)[32].

1.3 GEM誘導(dǎo)的DNA損傷 dFdCTP競爭性結(jié)合DNA后,PDAC細(xì)胞周期過程被阻斷在G1/S相,機(jī)制主要是其誘導(dǎo)的DNA(可能還有RNA)損傷,且在細(xì)胞水平上無法被修復(fù)[35].雖然“終止鏈屏蔽”導(dǎo)致核酸外切酶不能識別和修復(fù)這種DNA,但實(shí)際上,仍有一些切除修復(fù)酶能夠解決這一問題,其中包括DNA修復(fù)內(nèi)切酶ERCC1(ERCC Excision Repair 1),其主要負(fù)責(zé)DNA斷裂雙鏈的切割.研究顯示,ERCC1在GEM耐藥患者中過表達(dá),且可修復(fù)GEM誘發(fā)的鏈斷裂[36].除了“終止鏈屏蔽”直接機(jī)制中止DNA鏈的延長之外,GEM還可通過間接機(jī)制導(dǎo)致DNA鏈斷裂.GEM競爭性結(jié)合DNA后可以捕獲拓?fù)洚悩?gòu)酶I裂解復(fù)合體,并增強(qiáng)其穩(wěn)定性.拓?fù)洚悩?gòu)酶I(topoisomerase I,TOP-I)是參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等多種遺傳過程的關(guān)鍵酶之一.TOP-I裂解復(fù)合體的穩(wěn)定性可干擾DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄,其機(jī)制可能是TOP-I裂解復(fù)合體與復(fù)制或轉(zhuǎn)錄復(fù)合體之間碰撞頻率的增加導(dǎo)致了核酸鏈斷裂不斷的累積,最終造成整個(gè)DNA鏈的斷裂[37].這種作用又被稱為“TOP-I中毒”.GEM所致的TOP-I中毒造成了DNA鏈的斷裂并把細(xì)胞導(dǎo)向了死亡,因此TOP-I是GEM耐藥機(jī)制的重要靶點(diǎn)之一[8].除了誘導(dǎo)DNA損傷,GEM還以劑量依賴性和細(xì)胞依賴性的方式并入RNA,并抑制RNA的合成,盡管GEM的敏感性已證實(shí)與RNA結(jié)合量的差異相關(guān),但其具體機(jī)制仍不清楚[38].由于dFdCTP可能與CTP競爭結(jié)合RNA,高濃度dFdCTP對CTP合成酶的抑制可能是dFdCTP結(jié)合RNA增加和RNA合成抑制的主要原因[8].

1.4 GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 盡管GEM的細(xì)胞毒性作用與摻入DNA和RNA的藥物量顯著相關(guān),但其導(dǎo)致細(xì)胞死亡的下游分子途徑仍未完全闡明[8].凋亡是包括GEM在內(nèi)的細(xì)胞毒性藥物引發(fā)細(xì)胞死亡的主要方式,是細(xì)胞調(diào)節(jié)性死亡(regulated cell death,RCD)的一種,GEM所致的DNA損傷主要誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡(又稱“線粒體凋亡”)[39].內(nèi)源性凋亡的激活需要線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)的改變,這種改變導(dǎo)致線粒體促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C等的釋放,以觸發(fā)凋亡小體的形成并激活下游凋亡啟動(dòng)子caspase-9和效應(yīng)分子caspase-3,引發(fā)一系列的凋亡信號級聯(lián)反應(yīng).其中,MOMP受BCL-2基因家族的嚴(yán)格控制,該家族包括促凋亡(BAX、BAK等)和抗凋亡(BCL-2,BCL-xL和MCL-1等)成員[40].研究證實(shí),抗凋亡基因BCL-xL、MCL-1表達(dá)在對GEM獲得性耐藥的PDAC細(xì)胞中明顯上調(diào),而促凋亡基因BAX、BAK表達(dá)則顯著下調(diào),反復(fù)GEM暴露后上調(diào)BCL-xL、MCL-1增強(qiáng)了其對胰腺癌細(xì)胞的耐藥性,且BAX/BCL-2比值可預(yù)測GEM的敏感性[41],BCL-xL表達(dá)增強(qiáng)與PDAC患者生存期縮短相關(guān)[42].因此,BCL-2家族促凋亡和抗凋亡基因成員之間的平衡一定程度上決定了胰腺癌細(xì)胞對GEM的敏感性[43].此外,促凋亡蛋白必須由唯BH3(BH3-only)蛋白激活后才能啟動(dòng)MOMP改變.除了激活促凋亡蛋白,單結(jié)構(gòu)域的唯BH3蛋白家族(BID、BIM等)還可抑制抗凋亡蛋白,共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生.最新的一項(xiàng)研究顯示,上調(diào)唯BH3蛋白BIM可增加了PDAC細(xì)胞中GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[44].因此,靶向唯BH3蛋白表達(dá)是提高GEM化療敏感性的新策略[45].當(dāng)然,內(nèi)源性凋亡下游級聯(lián)信號的激活還涉及多種caspase(如caspase-9/-3/-7等)關(guān)鍵酶,這表明caspase也是評估GEM耐藥性的重要標(biāo)志物[46].最后,抑癌基因p53也與GEM的化療敏感性有關(guān),這依賴于p53蛋白對基因組完整性的維持和對凋亡的調(diào)控作用[47].研究顯示,p53在GEM處理的野生型p53細(xì)胞系中明顯上調(diào),且細(xì)胞中的BCL-2、BCL-xL蛋白水平降低,BAX蛋白水平升高.然而,突變型(失活)p53細(xì)胞中BCL-2水平則沒有明顯變化[48].因此,野生型p53通過促進(jìn)了凋亡增加了GEM的化療敏感性,而失活的p53則可能是通過激活促增殖JAK2-STAT3信號通路誘導(dǎo)了GEM耐藥[49].

近年來,伴隨著自噬依賴性死亡、鐵死亡(Ferroptosis)等新的RCD形式不斷被發(fā)現(xiàn)[39],其在化療耐藥中的作用也逐漸受到重視,并為克服癌癥耐藥性研究提供了新的方向.自噬是一種受控的分解代謝過程.一方面,自噬可以消除功能失調(diào)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,保護(hù)癌細(xì)胞免受化療藥的毒性損傷;另一方面,在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下,自噬還會觸發(fā)自噬依賴性細(xì)胞死亡,從而逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥性[50,51].因此,腫瘤自噬在化療耐藥性中的作用可能是雙向的.體外和體內(nèi)的研究均證實(shí),自噬主要是通過抑制PDAC細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)對GEM的抵抗作用,抑制自噬可以增強(qiáng)GEM的化療敏感性[52].最新一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)(NCT01506973)結(jié)果表明,自噬抑制劑硫酸羥氯喹(HCQ)聯(lián)合GEM+紫杉醇治療PDAC可明顯提高總體緩解率,但遺憾的是未能改善1年總體生存率[53].另一項(xiàng)關(guān)于自噬相關(guān)蛋白VMP1(vacuole membrane protein 1)的研究顯示,GEM可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞VMP1表達(dá)并與對其耐藥相關(guān),基于RNAi (RNA interference)技術(shù)的VMP1的基因失活可對抗這種耐藥反應(yīng),這一結(jié)果提示VMP1可作為對抗GEM耐藥的潛在治療靶點(diǎn)[54].至于PDAC中自噬依賴性細(xì)胞死亡與GEM耐藥之間的關(guān)系,目前仍不清楚.其中,自噬相關(guān)基因Beclin-1介導(dǎo)的自噬依賴性細(xì)胞死亡可能通過誘導(dǎo)凋亡來增強(qiáng)對GEM的敏感性,而ROS/Akt/mTOR信號軸則可能參與抵抗這一作用[55].另外,Ferroptosis也是一種新定義的鐵依賴性非凋亡細(xì)胞死亡形式,與Kras基因突變密切相關(guān),并以細(xì)胞內(nèi)鐵的積累和隨后的脂質(zhì)過氧化為特征[56].Kras基因是PDAC中最常見的突變基因,因此靶向Ferroptosis作為一種胰腺癌治療的新策略備受關(guān)注,但Ferroptosis與GEM作用之間關(guān)系的研究仍十分有限[57].最近的一項(xiàng)研究顯示,Kras/ERK信號傳導(dǎo)途徑下游的ARF6蛋白可通過降低RSL3(一種Ferroptosis的誘導(dǎo)分子)誘導(dǎo)Ferroptosis的敏感性,抑制Ferroptosis通路,并下調(diào)dCK和hENT1表達(dá),增強(qiáng)GEM的耐藥性[58].因此,Ferroptosis通路的抑制也可能參與了PDAC對GEM的耐藥過程.

2 GEM與能量代謝

通過對GEM敏感與耐藥的PDAC細(xì)胞系間的能量代謝譜分析發(fā)現(xiàn),兩者之間存在明顯差異,這提示GEM耐藥可能與葡萄糖、氨基酸和脂質(zhì)的代謝密切相關(guān)[59].因此,PDAC的代謝特征研究能為抗GEM耐藥治療提供新的策略.

2.1 葡萄糖代謝 乏氧和有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))是PDAC細(xì)胞能量代謝的重要特征[60].研究表明,誘導(dǎo)GEM耐藥的PDAC細(xì)胞中出現(xiàn)有氧糖酵解增加和活性氧成分(reactive oxygen species,ROS)降低,這一代謝轉(zhuǎn)化是由缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α通過誘導(dǎo)參與糖酵解途徑的酶和過表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter,GLUT)介導(dǎo)的.糖酵解通過下調(diào)ROS水平進(jìn)一步誘導(dǎo)并維持腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)表型,增強(qiáng)對GEM的化療抵抗[61].因此,靶向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平是GEM增敏的新策略,且這一過程可能涉及Ferroptosis[62].此外,HIF-1α還可通過增加糖酵解促進(jìn)DNA合成必需的非氧化磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)及嘧啶生成,導(dǎo)致細(xì)胞dCTP池增加,從而減少dFdC并入DNA,減弱GEM的細(xì)胞毒性.除了缺氧,跨膜黏蛋白MUC1的表達(dá)增加也能激活和穩(wěn)定HIF-1α,產(chǎn)生類似的作用.因此,抑制MUC1、HIF-1α、PPP或嘧啶合成均可增敏GEM[63].有趣的是,最近一項(xiàng)研究顯示,PDAC核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體hENT1過表達(dá)也可以通過HIF-1α抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解,逆轉(zhuǎn)GEM耐藥.這為18F-FDG PET評估靶向hENT1逆轉(zhuǎn)GEM耐藥的療效提供了可能[64].果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase 1,FBP1)是PDAC糖異生過程中的關(guān)鍵酶之一,對有氧糖酵解有負(fù)調(diào)節(jié)作用.泛素特異性蛋白酶44(ubiquitin specific peptidase 44,USP44)可促進(jìn)FBP1去泛素化以增加胰腺癌中FBP1蛋白的表達(dá),USP44在PDAC細(xì)胞中被下調(diào),介導(dǎo)了糖酵解增加與GEM耐藥[65].含F(xiàn)-box/WD重復(fù)序列的蛋白質(zhì)7(F-box and WD repeat Domain containing 7,FBW7)是一種可被癌基因KRAS突變抑制的PDAC抑制因子,FBW7以c-Myc依賴性方式調(diào)節(jié)硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)表達(dá),后者能抑制糖酵解并增強(qiáng)GEM在異種移植模型中的療效.但直接靶向KRAS或c-Myc的治療策略目前在技術(shù)上是困難的,因此,干擾c-Myc介導(dǎo)的下游效應(yīng)分子有望成為克服GEM耐藥的治療新途徑[66].此外,胰腺癌細(xì)胞較鄰近的正常組織表達(dá)更多的煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt),Nampt是參與糖酵解氧化還原反應(yīng)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)生物合成的關(guān)鍵限速酶.過表達(dá)的Nampt提供大量NAD,增加PDAC細(xì)胞糖酵解,有助于GEM抵抗,而抑制Nampt則可逆轉(zhuǎn)這種抵抗[67].在胰腺癌細(xì)胞中,TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡的調(diào)控子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator gene,TIGAR)表達(dá)增加并促進(jìn)其生存,TIGAR是野生型TP53的下游基因,突變型TP53可以干擾TIGAR表達(dá),促進(jìn)糖酵解和ROS相關(guān)的自噬[68].因此,TIGAR表達(dá)干擾也可能是突變型TP53所致GEM耐藥的原因之一.

2.2 氨基酸代謝 有關(guān)氨基酸代謝變化在GEM化療耐藥中作用的研究仍十分有限.在各種氨基酸中谷氨酰胺(glutamine,Gln)是氮和碳的主要來源,對癌細(xì)胞的生存至關(guān)重要.PDAC細(xì)胞中Gln攝取和分解增加,Gln代謝增強(qiáng)促進(jìn)葡萄糖代謝的另一個(gè)分支(為糖基化提供底物)己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthesis pathway,HBP)和糖基化.與生物合成機(jī)制有關(guān)的蛋白糖基化異常是PDAC的重要特征[69].其中,N-糖基化活性的提高可能與TGF-β、TNF和NF-κB等幾種信號通路有關(guān),并且抑制N-糖基化可以顯著改善胰腺癌細(xì)胞的耐藥性[70].另外,L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(L-type amino acid transporter-2,LAT2)是一種中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也是PDAC中的一種致癌蛋白,可以激活Gln依賴的mTOR信號通路,抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)糖酵解,導(dǎo)致對GEM耐藥,而抑制mTOR可以逆轉(zhuǎn)這一過程[71].因此,干擾Gln代謝途徑是抵抗GEM耐藥的新靶點(diǎn)[72].PDAC對蛋氨酸(methionine,Met)的需求增加,又被稱為Met依賴.干擾Met可選擇性在細(xì)胞周期的S/G2期阻滯癌細(xì)胞,促使癌細(xì)胞對化療敏感.Met主要來自食物,但通過低蛋白飲食限制Met的攝入十分困難.最近一項(xiàng)研究顯示,用重組蛋氨酸酶(recombinant methioninase,rMETase)靶向干擾PDAC細(xì)胞Met代謝可實(shí)現(xiàn)對GEM的增敏.由于癌組織吸收的Met遠(yuǎn)多于周圍的正常組織,因此可通過11C-MET-PET成像提供顯著的Met信號評估靶向Met治療的療效[73].此外,絲氨酸(serine,Ser)的生物合成也可能是PDAC細(xì)胞化療耐藥的組成部分.Ser對癌細(xì)胞增殖過程中的核苷酸和氨基酸合成至關(guān)重要,有助于DNA損傷的修復(fù).誘導(dǎo)GEM耐藥的PDAC細(xì)胞可通過MAPK級聯(lián)反應(yīng)上調(diào)Ser生物合成酶的表達(dá),促進(jìn)Ser合成.BRAF 抑制劑(維羅非尼等)可抑制MAPK級聯(lián)反應(yīng),提高對GEM的敏感性[74].

2.3 脂質(zhì)代謝 脂質(zhì)代謝也是癌癥進(jìn)展的必要條件之一,其不僅為胞膜的形成提供了充分的物質(zhì)基礎(chǔ),而且為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾提供了信號分子和底物[75].在PDAC中,參與從頭合成脂肪酸、膽固醇途徑的許多酶如脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)等明顯上調(diào),FASN是一種多功能蛋白同型二聚體,可以將乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為棕櫚酸酯,從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)生成[76].FASN的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP1c)調(diào)控,后者是PI3K/Akt、MEK/ERK等信號通路的下游[75].其中,高表達(dá)的FASN可上調(diào)丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)的表達(dá)和P53信號通路,促進(jìn)糖酵解和抑制凋亡,引發(fā)GEM抵抗[77,78].此外,高表達(dá)的FASN還可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,維持CSC表型,抑制GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.一項(xiàng)研究亦證實(shí),在PDAC原位動(dòng)物模型中抑制FASN可增加GEM的敏感性[79].不同的脂肪酸也在PDAC細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮重要作用,但具體機(jī)制仍待研究[6].ω3不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids,ω3-PUFA)可通過抑制促生存的NF-κB和Akt/STAT3通路活化,增強(qiáng)GEM的抗癌作用[80].一項(xiàng)已完成的II期臨床試驗(yàn)(NCT0109382)顯示,GEM聯(lián)合靜脈ω3-PUFA治療,轉(zhuǎn)移性或局部晚期PDAC患者的促炎循環(huán)生長因子和細(xì)胞因子減少,并有助于改善預(yù)后[81].除脂肪酸外,膽固醇代謝也參與了PDAC的進(jìn)展.膽固醇含量變化介導(dǎo)了如ERK1/2、PI3K/Akt、EGFR依賴的促生存途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo).在異種小鼠模型中,用shRNA (small hairpin RNA)沉默低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)可抑制膽固醇攝取,增強(qiáng)GEM的細(xì)胞毒性[82].他汀類藥物是膽固醇從頭合成途徑的抑制劑,現(xiàn)已證實(shí)可提高PDAC患者的生存率,但與GEM耐藥間的關(guān)系仍待明確[83].一項(xiàng)針對晚期PDAC的Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示,辛伐他汀聯(lián)合GEM并未能提高GEM的療效(NCT00944463)[84].總之,越來越多的證據(jù)證實(shí),PDAC細(xì)胞脂質(zhì)代謝與GEM耐藥之間存在密切關(guān)系,抑制脂質(zhì)代謝有助于克服耐藥[6,85].

3 GEM與EMT

EMT是PDAC等上皮癌的細(xì)胞表型由上皮型向更具侵襲性的間充質(zhì)型轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過程[86].越來越多的證據(jù)表明,EMT與PDAC細(xì)胞的GEM化療抵抗密切相關(guān)[87,88].EMT通過上皮標(biāo)記物(如E-鈣黏蛋白、細(xì)胞角蛋白等)的下調(diào)和細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物(如波形蛋白、N-鈣黏蛋白、纖連蛋白等)的上調(diào),造成細(xì)胞間失接觸(封閉蛋白下調(diào)),使癌細(xì)胞獲得侵襲和遷移特性,同時(shí)獲得對GEM的天然抵抗力[89].這一結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)化是通過TNF-α、TGF-β、HIF-1α、Wnt、Notch、RAS和NF-κB等介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(Snail、Slug、ZEB-1、ZEB-2和Twist等)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,但間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子下游的分子信號目前仍未明確[90,91].E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)是EMT的表型標(biāo)志,這一過程受間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)性調(diào)控[90].基因表達(dá)譜分析表明,細(xì)胞系對GEM的先天耐藥性與E-鈣黏蛋白的低表達(dá)和ZEB-1的高表達(dá)有關(guān).與先天耐藥機(jī)制不同,最近一項(xiàng)研究顯示,PDAC的獲得性耐藥僅出現(xiàn)在GEM誘導(dǎo)的間充質(zhì)樣細(xì)胞中,且這一過程由ERK/ZEB-1途徑介導(dǎo),此時(shí)抑制ERK1/2磷酸化或ZEB-1表達(dá)可增敏GEM,但預(yù)先處理則不會產(chǎn)生類似的效果[88].這或許是MEK/ERK抑制劑(曲美替尼等)聯(lián)合GEM治療晚期PDAC臨床試驗(yàn)(NCT01231581、NCT01016483)失敗的原因之一[92,93].總之,EMT狀態(tài)變化與GEM耐藥性密切相關(guān),靶向抑制EMT是PDAC克服GEM耐藥的新策略.

4 GEM與非編碼RNA

近年來,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微小RNA(microRNA,miRNA)和長非編碼RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)已被證實(shí)在PDAC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[94].miRNA是一類由19-25個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA,是一種基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子.miRNA通過與目標(biāo)mRNA的3’端非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)結(jié)合,并促進(jìn)目標(biāo)mRNA沉默或降解,抑制蛋白質(zhì)翻譯,實(shí)現(xiàn)對相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控[95].越來越多證據(jù)顯示,miRNA失調(diào)(如miRNA-410-3p、miRNA-146a-5p等)可通過不同的促生存信號通路(自噬、NF-κB等)介導(dǎo)GEM抵抗[96,97].其中,miRNA靶向EMT途徑關(guān)鍵蛋白的mRNA并促進(jìn)EMT可能也參與了這一過程[98].此外,lncRNA也可促進(jìn)PDAC對GEM的抵抗,但具體機(jī)制仍不清楚[99].部分lncRNA和最近發(fā)現(xiàn)的特殊類型環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)可通過與miRNA結(jié)合并競爭性隔離其生理靶標(biāo),從而負(fù)性調(diào)控miRNA的活性,這類lncRNA又被稱為“miRNA海綿”[94].因此,lncRNA作為miRNA海綿對miRNA活性調(diào)控作用可能是GEM化療抵抗的原因之一[99,100].總之,ncRNA參與了PDAC對GEM的化療抵抗,靶向miRNA和miRNA海綿已成為研究新熱點(diǎn),并終將為改善GEM耐藥提供新的策略[101].

5 結(jié)論

自GEM首次報(bào)道以來的20余年中,其單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用已成為PDAC治療最常用的一線治療方案.盡管最新的臨床試驗(yàn)確立了其他如FOLFIRINOX等新的一線治療選擇,但毒副作用的增加限制了其臨床應(yīng)用.因此,GEM仍是晚期PDAC姑息治療的基石.對GEM的化療耐藥是影響PDAC治療效果的決定性因素.隨著分子生物學(xué)的持續(xù)進(jìn)展,新的參與GEM抵抗的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制不斷被揭示,這些研究有助于為化療增敏策略的開發(fā)提供新方向(圖2,表1).然而,目前一些針對腫瘤相關(guān)分子途徑的治療并沒有取得令人滿意的結(jié)果,部分原因是替代代償途徑的快速上調(diào),而且腫瘤的異質(zhì)性和體內(nèi)、體外試驗(yàn)的差異更增加了其復(fù)雜程度,這可能是部分臨床試驗(yàn)失敗的原因之一.因此,按異質(zhì)性分層PDAC并開發(fā)更精準(zhǔn)的GEM增敏方案將是未來研究發(fā)展的重點(diǎn).